Anti-aging effect of Baoyuan Decoction on Caenorhabditis elegans
Zhang Xunle Wang Yushan Zhao Jiahui Huang Jiaqing Wen Wu Gong Yuesong
(Nanjing University of Chinese Medicine, Nanjing 210046, China)
Objective: To study the effect of various concentrations of Baoyuan Decoction on the lifespan of Caenorhabditis elegans (C. elegans) and to investigate the anti-aging mechanism of Baoyuan Decoction. Methods: The lifespan test cincluded the control group, the solvent control group and the Baoyuan Tang extract group (50, 100, 200, 500 μg/ml, 1 mg/ml). The effect of Baoyuan Decoction on the average lifespan of nematodes was monitored. Physiological indicators such as exercise capacity, head swing and anti-stress ability were also tested. Results: 1. Compared with the control group, the average life expectancy of nematodes was significantly prolonged at 200,500 μg/ml and 1 mg/ml in the Baoyuan decoction group. 2. Physiological indicators: Baoyuan Tang extract did not significantly change the probiotic fertility ofnematodes compared with that of the control group (P>0.05); Baoyuan Tang extract significantly increased the number of crawling peaks in 1min and increased the frequency of nematode head swing (P<0.05). 3. Stress test: Compared with the control group, f Baoyuan Decoction extract significantly increased the resistance of C. elegans to heat stress and oxidative stress (P<0.05). Conclusion: Baoyuan Tang extract can effectively prolong the average lifespan of nematodes and has anti-aging effect，which could be related to its increasing the anti-stress effect in nematodes.
[Key words] Baoyuan Tang; Caenorhabditis elegans; lifespan; stress
保元汤最早见于明代魏直的《博爱心鉴》，是治疗元气虚弱的著名方剂，组方包含黄芪、人参、甘草、肉桂 四味药材。全方可大补元气，尤补后天脾肺之气，健脾保肺温肾，能治一切元气虚弱之症，故名保元[1,2]。经历代医家数百年的运用验证，保元汤临床效果确切。随着现代进一步的研究，保元汤的临床作用也不断被推广，相关的药理学研究表明保元汤在免疫系统、血液系统、心血管系统及抗氧化等方面有较好的作用[3-5]。基于这些作用由此可见，预示保元汤具有一定的抗衰老作用，为此，利用秀丽隐杆线虫 （Caenorhabditis elegans），以下简称线虫，作为模型研究其可能的抗衰老作用，有可能会发现其更多的功效。
线虫是广泛应用于遗传学、发育生物学、细胞生物学等领域的模式生物，近年来也用于揭示先天免疫、氧化胁迫效应、环境暴露与损伤的机制[6]。秀丽隐杆线虫具有生活周期短、易饲养、生物学终点多、在实验室可大量培养等特点，已成为衰老研究中常用的模式生物，并拥有与哺乳动物同源的抗氧化胁迫机制和相关基因[6,7]。本文主要研究了保元汤提取物对线虫寿命的延长作用，并初步探究了保元汤延长线虫寿命的机制，结果显示保元汤提物能够有效延长线虫的平均寿命，具有延缓线虫的衰老作用，其延缓衰老作用机制可能与提高线虫抗应激能力有关。
1材料与方法
1.1虫株与菌株 本实验中虫株野生型N2线虫。线虫的培养采用线虫生长培养基，以Escherichia coli OP50 饲喂，采用标准程序在20 ℃培养。
1.2 试剂 NGM 培养基：1000ml培养基 NGM 3gNaCl，2.5g蛋白胨，17g 琼 脂，25ml K2HPO4－KH2PO4缓冲液（1mol/l），pH 6.0，975ml ddH2O，灭菌后加入除菌的 1ml胆固醇溶液(5mg/ml)，1ml 1mol/LMgSO4 和1ml1mol/L CaCL2。
LB培养基：1000ml LB培养基 5g NaCl ，10g胰蛋白胨，5g 酵母提取物，加ddH2O定容至1L，高压灭菌。
S-培养基：50ml K2HPO4－KH2PO4缓冲液（1mol/l），pH 6.0，5.9g NaCl，加水定容至1L，高压灭菌，冷却后加1ml胆固醇溶液(5mg/ml)，混匀后，量取977ml，加 10ml 1M柠檬酸钾缓冲液，pH 6.0，10ml 痕量金属溶液，3ml 1mol/LMgSO4 和3ml1mol/L CaCL2。
FUDR（fluorodeoxyuridine）:100 mg FUDR溶于670ml S-培养基，分装，-20℃保存。
百草枯：1g百草枯溶于纯水，配制成1mol/L母液， 4℃保存。
1.3仪器 超净工作台，体视显微镜，倒置显微镜，高压灭菌锅，生化培养箱，离心机
1.4 方法
1.4.1药物提取 依据保元汤方中药物比例称取药材粉30g，加10倍量水回流提取1h,提取3次，合并3次药液，旋转蒸发至100ml.采用真空冷冻干燥法获得保元汤粗提物。
1.4.2 线虫培养 于空白的NGM上中央滴入50μl左右的OP50菌液，均匀用涂布器将菌液涂布，注意菌液边缘不宜太过，应距离平板边缘5mm左右，采用团块法将线虫接种在含大肠杆菌的NGM培养基上，20°C培养箱中恒温培养[8]。
1.4.3 线虫同步化处 用液体NGM冲下培养基中的L4期成虫。转至10ml无菌离心管中，1300g离心1min,洗涤2次，保留与约0.25mlNGM,加,无菌水3.75ml,加碱裂解液（0.5ml 5mol/L NaOH ,1ml Bleach）至，混匀振荡，每2min至于镜下检测线虫裂解状态，裂解时间不超过6min。1300g离心1min,液体NGM洗涤2次，S-培养基洗涤2次，移除上清，加S-培养基8ml,置于20℃培养箱中振摇孵育24h[9]。
1.4.4 寿命实验 根据文献关于线虫筛选药物的方法[10,11]。本实验线虫均采用同期化的L4期秀丽隐杆线虫，选用96孔板液体培养法进行寿命监测实验。线虫由卵成长至L4期，进行给药处理，从给药当天，线虫年龄标记为0天。实验组分为空白对照组、溶剂对照组、给药组，药物剂量选用1mg/ml、500μg/ml、200μg/ml、100μg/ml、50μg/ml，培养条件20℃恒温。每天观察线虫的状态，记录存活、死亡数量。观测前将96孔板置于摇床上轻轻振摇2min。线虫死亡判定标准为振动或强光刺激线虫不弯曲身体或头部不摆动，身体呈僵直状态。记录线虫的死亡数目，并计算存活率。存活率（%）=（线虫总数-死亡数目）/线虫总数×100 %。 最后一条线虫死亡时的天数即为最长寿命。前期每两天统计存活率，第23或第24天起，每天统计一次存活率，直至线虫全部死亡为止。
1.4.5 线虫生殖力测定 参考文献所述方法[12,13]。同步化后线虫，培养直L1期，药物处理，此过程不加抑制繁殖药物FUDR 。药物处理48好后，用移液器吸取线虫，转至标注好的1.5ml离心管中，1300g离心1min。移除上清，加M9缓冲液，1300g离心1min，重复2次。移液器吸取线虫至空白NGM培养皿上，每板1条，每实验组各15条线虫。转移至20℃培养箱中培养24h后，显微镜下观察统计每块培养皿上的虫卵数目。
1.4.6运动能力测定 根据文献所述方法[14,15]。运动能力可反映线虫的生命活力，线虫在运动过程中以正弦曲线的形式向前移动，当衰老的线虫运动能力下降，反映在运动弯曲的频率下降，曲线变的无规则，幅度下降等。同步化后线虫，培养直L4期，药物处理6天，用移液器吸取线虫，转至标注好的1.5ml离心管中，1300g离心1min。移除上清，加M9缓冲液，1300g离心1min，重复2次。移液器吸取线虫至空白NGM培养皿上，每板5条，线虫自由运动1min后，统计线虫1分钟内运动S形的个数（即1min内走过的峰数）。每组统计15只线虫，重复3次。
1.4.7 头部摆动测定 参考文献所述方法[16]。同步化后线虫，培养直L4期，药物处理6天后，用移液器吸取线虫，转至标注好的1.5ml离心管中，1300g离心1min。移除上清，加M9缓冲液，1300g离心1min，重复2次。移液器吸取线虫至空白NGM培养皿上，每板5条，线虫自由运动1min后，于体视显微镜下记录其在 1min 内头部摆动次数。线虫头部摆动行为定义为头部摆动方向改变，且改变角度大于90度。
1.4.8热应激 根据文献所述方法[19,20]同步化后线虫，培养直L4期，药物处理2天后。将96孔板上线虫一起转封口膜去除移到 35℃培养箱中热应激 10小时，然后再将其转移到 20℃培养箱中继续培养，每天记录线虫死亡、存活条数，直至对照组线虫存活率小于10%。
1.4.9氧化应激 根据文献所述方法[13,19]同步化后线虫，培养直L4期。药物处理2天后，各实验组分别加入20 mM百草枯，进行氧化应激处理，培养24后，开始统计线虫死亡、存活条数，直至对照组线虫存活率小于10%。
实验数据统计学方法采用GraphPad Prism 5.02进行统计分析，以平均值士标准误表示，组间比较采用ANOVA分析。P<0.05 视为两组数据之间的差异有统计学意义，“*”表示两组之间在 P<0.05 的水平差异显著，“**”表示两组之间在 P<0.01 水平差异显著，“***”表示两组之间在 P<0.001水平差异显著。
2 结果
2.1 线虫寿命实验结果 保元汤寿命实验结果说明，保元汤提物组线虫平均寿命均明显延长，分别延长了17.08%（100μg/ml 组）、20.65%（200μg/ml 组）和18.23%（ 500μg/ml组），溶剂对照组线虫平均寿命与空白组比较差异无统计学意义。由结果可以看出保元汤提取物在较低剂量时就能够有效的延长线虫的平均寿命。。
图1 A、B 保元汤提物不同浓度下线虫生存曲线（20℃）；B保元汤提物不同浓度下线虫平均寿命。 *P<0.05，**P<0.01，***P<0.001VS.control。
2.2生殖力实验结果 线虫经保元汤提取物处理后，线虫的产卵量与空白对照组相比没有显著性差异，无统计学意义（P>0.05）。即说明，保元汤能延缓线虫衰老而不影响线虫生殖功能。
图 2 保元汤提物对线虫生殖力的影响。与对照组比较无显著差异，P>0.05。
2.3运动能力实验结果 运动能力可反映线虫的生命活力，线虫在运动过程中以正弦曲线的形式向前移动，当衰老的线虫运动能力下降。所以我们通过观察线虫运动来辅助证明药物延缓衰老的作用。保元汤提物在一定剂量范围内（200、500μg/ml、1mg/ml）均能显著提高线虫运能力，线虫在1min内爬行峰数次数显著增加（P<0.05）。
图3 保元汤提物对线虫运动能力的影响（*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001VS.control）。
2.4 头部摆动实验结果 线虫头部摆动能力在一定程度上反映线虫的衰老，其头部摆动与身体肌壁组织、摄食行为有一定的关系。保元汤提物在一定剂量范围内（200、500μg/ml、1mg/ml）均能显著提高线虫头部摆动，线虫在1min内头部摆动次数显著增加（P<0.05）。
图4保元汤提物对线虫头部摆动的影响（*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001VS.control）。
2.5热应激实验结果 保元汤提取物可以显著提高线虫的耐热能力。35℃热应激后的第1天和第2天，药物（200、500μg/ml、1mg/ml）均非常显著的提高了线虫的存活率，与空白组比较有统计学差异（P＜0.05），热应激后的第3天空白组线虫几乎全部死亡，而给药组还有约10%以上线虫存活且200、500μg/ml、1mg/ml剂量下存活率更高。
图6 A、B、C、D、E保元汤提物对线虫热应激能力的影响（*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001VS.control）。
2.6 氧化激实验结果 保元汤提取物可以显著提高线虫抵抗百草枯氧化损伤的能力。氧化应激处理第1天、第2天和第3天，药物（200、500μg/ml、1mg/ml）均非常显著的提高了线虫的存活率，与空白组比较有统计学差异（P＜0.05），氧化应激后的第4天空白组线虫几乎全部死亡，而给药组还有约10%以上虫存活且200、500μg/ml、1mg/ml剂量下存活率更高。
图7 A、B、C、D、E保元汤水提物对线虫氧化应激能力的影响（*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001VS.control）。
3讨论衰老又称老化，指生物体在正常状况下发育成熟后，随着年龄的增加，机体在退化时期生理功能下降和紊乱的综合表现，最终导致生命体的死亡的过程，因此，在延缓衰老的研究中寿命的长短可作为衰老的一个定量指标[21-0]。本实验中保元汤水提取物在一定剂量范围内可明显延长线虫的寿命，表明保元汤对线虫而言有延缓衰老的作用。在衰老领域，长寿和生殖总是被联系在一起，且普遍认为寿命与其生殖能力成反比关系。对大多数生物体而言，当生殖期结束，机体就逐渐开始呈现衰老。研究认为，包括线虫、黑腹果蝇和人类等有机体都有通过干预生殖功能来实现延长寿命的可能性，不过，目前这个观点还有颇多争议[22]。实验的研究结果表明，保元汤延缓线虫衰老的同时并没有影响其产卵量，保元汤对线虫没有生殖毒性，也不是通过抑制生殖来延长寿命的。本实验研究中，同时观察了线虫的运动能力、头部摆动、身体摆动频率，从实验数据来看，保元汤能提高线虫的活动能力，这些可能是抑制了衰老过程中神经系统和肌肉的退化。与空白对照组相比，药物组线虫的运动能力、头部摆动在一定及剂量范围内有显著统计学差异，说明保元汤在延长线虫寿命的同时对线虫的正常运动功能无损害。
有研究报道表明压力应激抵抗能力的提高与生物体寿命延长有关[?]，研究发现几乎所有已知的长寿突变体线虫在热应激、氧化应激、重金属毒性压力和紫外线放射压力下，都显示出了更强的抵抗外界环境压力的能力。因此，压力应激实验的结果可作为检测药物延寿作用的常规指标之一。本实验中用 20m M 百草枯处理各实验组，结果显示药物预处理的线虫抗氧化应激能力明显提高。本实验中用 20mM 百草枯处理各实验组，结果显示药物预处理的线虫抗氧化应激能力明显提高。除了氧化应激，热应激也是衰老研究中常用的实验指标之一，在相关线虫长寿突变株的研究中发现，提高转录因子 HSF-1 表达，也能延长线虫的寿命和提高应激抗性[23,24]。本实验结果显示在热应激条件下，保元汤提取物预处理过的线虫表现出了明显的抗热应激能力。这一结果预示保元汤抗线虫衰老的作用可能与转录因子 HSF-1有关，其相互关系有待进一步的研究。同样，保元汤延缓衰老机制也有待更深入和广泛的研究。
[参考文献]
[1]李艳青,张重华,王均宁.保元汤溯源[J].中医文献杂志,2014,32(04):15-16.
[2] 李艳青. 保元汤及其类方研究[D].山东中医药大学,2006.
[3] 孔勇杰. 参芪保元汤治疗慢性心力衰竭患者临床观察[D].广州中医药大学,2015.
[4] 杨万杰.研究保元汤对老年心气不足型冠心病并慢性心力衰竭心功能的作用影响[J].世界最新医学信息文摘,2018,18(25):153+155.
[5] 莫云秋,唐静,康善平,伍松姣,李柏华,王铁华.保元汤对老年心气不足型冠心病并慢性心力衰竭心功能的影响[J].中西医结合心血管病电子杂志,2016,4(03):62-63.
[6] Hartwig K, Heidler T, Moch J. Feeding a ROS-generator to Caenorhabditis elegans leads to increased expression of small heat shock protein HSP-16.2 and hormesis [J]. Genes Nutr, 2009, 4(1): 59-67.
[7] Zhang L, Jie G, Zhang J, et al. Significant longevity effects of EGCG on C. elegans under stress [J]. Free Radic Bio Med, 2009, 46(3): 414-421.
[8] Stiernagle T. Maintenance of C. elegans[M]. WormBook. 2006,2（11）:1-11.
[9] Solis GM, Petrascheck M. Measuring Caenorhabditis elegans life span in 96 well microtiter plates[J].Journal of Visualized Experiments, 2011; (49): 2496.
[10]刘鹏. 以线虫为模型研究中药中活性成份的生物学功能及中药紫苏梗降糖功能的研究[D].吉林大学,2013.
[11]张娇龙. 齐墩果酸对秀丽隐杆线虫寿命的影响及分子机制研究[D].天津大学,2016.
[12]许云,阮秦莉,纪蕾蕾,等.芫花素对模式生物秀丽隐杆线虫的毒性作用[J].中国药理学与毒理学杂志,2017,31(05):414-421.
[13]唐晓明. 香豆素对秀丽隐杆线虫抗氧化作用研究[D].长春理工大学,2012.
[14]郭佑铭. 以秀丽隐杆线虫为模型的铃兰毒甙抗衰老研究[D].吉林大学,2014.[15]王雪. 松果菊苷对秀丽隐杆线虫寿命的影响及分子机理研究[D].天津大学,2015.
[16]路璐璐. 毛蕊异黄酮对秀丽隐杆线虫寿命的影响及分子机制研究[D].天津大学,2017.
[17]王艳菊. 葡萄籽原花青素对秀丽隐杆线虫生命周期的影响[D].北京林业大学,2014.
[18]王艳菊. 葡萄籽原花青素对秀丽隐杆线虫生命周期的影响[D].北京林业大学,2014.
[19]Wang Q,Yang F,Guo W,et al.Caenorhabditis elegans in Chinese Medicinal Studies:Making the Case for Aging and Neurodegeneration[J].Rejuvenation research,2014,17(2)205-208.
[20]Qin-Li Wan,Xiao huo Shi,Jiangxin Liu,et al.Metabolomic signature associated with reproduction -regulated aging in Caenorhabditis elegans[J].Aging,2017,9(2):447-463.
[21] Koen H, Braeckman B P, Johnson T E, et al. Life extension via dietary restriction is independent of the Ins/IGF-1 signalling pathway in Caenorhabditis elegans[J]. Experimental Gerontology, 2003, 38(9): 947~954.
[22]Katherine I. Zhou, Zachary Pincus, Frank J. Slack.Longevity and stress in Caenorhabditis Elegans[J].Aging, 2011,3(8):733-753.
[23Caroline Kumsta, Jessica T. Chang, Jessica Schmalz,et al.Hormetic heat stress and HSF-1 induceautophagy to improve survival and proteostasis in C.elegans[J].Nat Commun, 2017, 8:14337.
[24] Park HH,Jung Y, Lee SV. Survival assays using Caenorhabditis elegans [J].Molecules and Cells,2017,40(2):90-99.
