熊永爱¹ 赵强强² 王淼² 郑晓秋³ 谢兴亮³ 杨明^1*

   （成都中医药大学药学院中药材标准化教育部重点实验室  四川成都611137）

摘要: 目的 探究黄芪皂苷、黄芪多糖、苦参总碱三种活性组分配伍对实验性大鼠溃疡性结肠炎的治疗作用。方法  SD大鼠90只，雌雄各半，随机分为正常组、TNBS模型组，柳氮磺胺吡啶阳性组、活性组分配伍高剂量组、活性组分配伍中剂量组和活性组分配伍低剂量组。治疗结束时处死动物取结肠，计算各组大鼠结肠肠重系数；测定各组大鼠结肠髓过氧化酶（MPO）活性及血清NO水平；取部分结肠做显微镜检查，评价黏膜损伤指数。结果  与模型组相比，阳性对照组、活性组分配伍高剂量组、活性组分配伍中剂量组肠重系数显著降低（p<0.05）；各给药组结肠组织MPO水平降低，其中活性组分配伍高剂量组、阳性对照组有显著性降低（p<0.05），中、低剂量组有降低趋势；各给药组血清中NO水平极显著性降低（p<0.01）；与模型组相比，各给药组结肠组织学损伤指数均显著降低，其中活性组分配伍高剂量组、阳性组有极显著性差异（p<0.01）。结论  黄芪皂苷、黄芪多糖、苦参总碱配伍能对抗三硝基苯磺酸导致的大鼠结肠组织病理损伤，能增强整体炎性免疫反应，明显改善动物便血、腹泻、少动等外观体征，疗效明显。

关键字   黄芪皂苷   黄芪多糖   苦参总碱    溃疡性结肠炎  

溃疡性结肠炎(Ulcerative Colitis，UC)又称非特异性溃疡性结肠炎，是发生在结、直肠粘膜层的一种弥漫性炎症性疾病，是炎症性肠病(Inflammato boweldisease，IBD)的一种^[1]。IBD已成为公认的慢性腹泻的主要病因，并被认为是胃肠道中除恶变外最严重的疾病之一。目前，溃疡性结肠炎的治疗主要采用西医治疗，西药对本病治疗的药物种类主要有氨基水杨酸类、肾上腺皮质激素类、免疫调节剂等^[2]，这些药物取得了一定的治疗效果，但其毒副作用较大，不能长期使用，常导致病情反复，因此新一代治疗溃疡性结肠炎的药物开发迫在眉睫。

 中药黄芪为豆科植物蒙古黄芪或荚膜黄芪的干燥根，具有益气固表、健脾升阳等功效，常用于治疗脾虚中气下陷、久泻久痢，痈疽难溃，久溃不敛。现代研究表明黄芪能增强机体非特异性和特异性免疫功能^[3]，清除氧自由基，抗生物氧化，降低体内自由基对组织的损伤，其物质基础在于它的活性组分黄芪皂苷和黄芪多糖^[3]。中药苦参为豆科植物苦参的干燥根，具有清热燥湿、祛风杀虫功效，常用于湿热泻痢；肠风便血。现代研究证明，苦参能介导机体炎症反应，降低毛细血管通透性，抑制肉芽组织增生，能对抗自由基氧化对细胞造成的伤害，对各种渗出性炎症均有明显的对抗作用，其物质基础在于其活性生物碱^[4]。

 基于以上研究事实，本研究拟以黄芪皂苷、黄芪多糖、苦参总碱三种活性组分为研究对象，探究这三种活性组分配伍对实验性大鼠溃疡性结肠炎的治疗作用。

1．材料

1.1 药材  

    黄芪、苦参，购于四川利民中药饮片有限责任公司，经成都中医药大学药学院中药药用植物栽培与鉴定裴瑾教授鉴定，所购药材均符合《中华人民共和国药典》标准。黄芪皂苷、黄芪多糖、苦参总碱的提取、分离及纯化工艺由成都中医药大学中药药剂实验室杨明教授提供。 

1.2 试剂   

   三硝基苯磺酸(TNBS)：购于sigma公司；NO试剂盒、髓过氧化物酶（MPO）试剂盒由南京建成生物工程研究所提供。

1.3 实验动物分组及给药  

SD大鼠适应一周饲养后，按体重随机分成6组，每组15只。正常组和模型组灌胃给予生理盐水，1次/日，每次2 mL/100g大鼠；阳性对照组0.6 g / kg灌胃给予柳氮磺胺吡啶溶液；活性组分配伍高剂量组按20ml/kg剂量灌胃给予活性组分混合溶液（每1ml药液中分别含有黄芪皂苷25.5mg 、黄芪多糖43.5mg、苦参总碱36mg）；活性组分配伍中剂量组每只按10ml/kg剂量灌胃给药；活性组分配伍低剂量组每只按5ml/kg剂量灌胃给药。

2 方法与结果

2.1 模型复制方法  

   实验前，将所有大鼠禁食24小时。24小时后，除正常组外，其他组大鼠腹腔注射20%乌拉坦溶液（6ml/kg）麻醉，将一直径约2mm长约12cm的橡胶输液管由肛门轻缓插人，深度为8cm，推人2%TNBS溶液100mg/kg，让动物保持平躺自然清醒^[5]。造模后第2天，待动物苏醒，按1.3将动物随机分组，给药，每天一次，连续7天。

2.2 检测指标

2.2.1 髓过氧化物酶（MPO）活性  

    按试剂盒说明书处理样本，并测定各组样本MPO活性用紫外检测器在460nm处测吸光值。

2.2.2血清NO水平

    大鼠股动脉采血，收集血液于试管中，室温静置自然凝固收缩后，于37℃水浴中，孵育20min，以4000r／min离心10min，分离血清，-20℃保存，按试剂盒规定方法检测。

2.2.3 光镜检查   

     剪取结肠病变最明显处2cm放于10%中性缓冲皂醛溶液中固定，酒精脱水，石蜡包埋，切片厚度4-6μm，HE染色，光学显微镜检查。

2.3 统计方法  计量质料采用t检验。

2.4 实验结果

2.4.1 外观体征的观察结果  

     各组动物造模后第2天均出现便血、腹泻情况，大多数动物出现厌食、懒动现象。与模型组相比，各给药组便血、腹泻程度较轻，持续时间缩短，其中阳性组和活性组分配伍高剂量组动物整体状态最好。

2.4.2 MPO活性测试结果   

    与模型组相比，各给药组能降低白细胞中MPO含量，其中活性组分配伍高剂量组、阳性对照组有显著性降低（p<0.05），表明高剂量组和阳性组药物均能降低结肠粘膜细胞炎症反应，MPO活性测试结果见表-1。      

                    表-1 MPO活性测试结果U·g^-1(±S，n=10)

                   注： 与模型组比较，**:P<0.01，*:P<0.05；

2.4.3  NO测试结果  

     与正常组比较，模型组大鼠血清中NO水平极显著性升高（p<0.01），表明大鼠整体处于异常增强的免疫炎性反应状态。与模型组相比，各给药组血清中NO水平极显著性降低（p<0.01），表明各组药物都能明显下调大鼠异常增强的整体免疫炎性反应状态。结果见表-2。

        表-2 大鼠血清NO水平测定结果(±S，n=10) 

  注： 与模型组比较，**:P<0.01，*:P<0.05；与阳性组比较，^△△P<0.01，^△P<0.05

2.4.4 结肠肠重系数

与模型组相比，阳性对照组、活性组分配伍高剂量、低剂量组肠重系数极显著降低（P<0.01），中剂量组显著性降低（P<0.05）。这项指标测试结果表明活性组分配伍组具有良好的对抗结肠炎性反应导致的组织增生作用。肠重系数比较结果见表-3。

2.4.5 光镜观察

模型组镜下可见溃疡，病变主要在粘膜下层，组织水肿明显及大量炎性细胞浸润，以淋巴滤泡增生为主，图见B和C。活性组分配伍中、低剂量组也可见溃疡，有较明显的组织水肿和大量炎细胞浸润，图见D、E和F。活性组分配伍高剂量组和柳氮磺胺吡啶组溃疡较少并可见已愈合的溃疡组织，组织水肿和充血明显减轻，炎细胞浸润明显减少，图见G和H。镜检评分结果比较见表-3。

          A-正常                                 B-溃疡

        C-纤维化                              D-淋巴滤泡增生

 E-糜烂                                 F-表浅溃疡

            G-高剂量组                          H-阳性组

             表-3  各组动物结肠肠重系数和组织损伤程度的结果(±S，n=10) 

                   注： 与模型组比较，**:P<0.01，*:P<0.05；

3.讨论

 目前溃疡性结肠炎的发病机制尚不明确，从已有的报道来看，自身免疫功能紊乱、细胞因子分泌失衡和氧自由基损伤作用是最主要的发病机制，其他如黏液素变异、黏附分子、T细胞异常调亡等也是其致病原因。该病致病因素多且复杂，常见有遗传、环境、免疫、促炎和抗炎因子失衡等因素。

 本实验选择黄芪和苦参两味药材中三种活性组分的配伍为研究对象，通过对TNBS致大鼠溃疡性的治疗作用，探究这三种活性组分配伍作用对溃疡性结肠炎的治疗作用。TNBS诱导的溃疡性结肠炎呈慢性变化，病程较长，各种炎症介质如PGE₂、TNB₂、LTC₄和IL等发生明显变化，MPO含量增高，与人类溃疡性结肠炎相似。实验结果显示，黄芪皂苷、黄芪多糖、苦参总碱配伍作用对溃疡性结肠炎确有良好的治疗作用，能对抗三硝基苯磺酸导致的大鼠结肠组织病理损伤，能增强整体炎性免疫反应，明显改善动物便血、腹泻、少动等外观体征，疗效明显。

 近年来研究表明，NO在神经、免疫、心血管等系统具有广泛而复杂的生理与病理作用。NO可以产生于人体内多种细胞，如当体内内毒素或T细胞激活巨噬细胞和多形核白细胞时，能产生大量的诱导型NOS和超氧化物阴离子自由基，从而合成大量的NO和H₂O₂，这在杀伤入侵的细菌、真菌等微生物和肿瘤细胞、有机异物及在炎症损伤方面起着十分重要的作用。本实验研究的三种活性组分能降低结肠粘膜细胞分泌的NO，表明三者联合作用能下调大鼠异常增强的整体免疫炎性反应状态，但详细的作用机理尚不明确，还需要进一步做深入细致的研究。

参考文献

[1] Darren N.Seril, Jie Liao, Guang-Yu Yang and Chung S.Yang.Oxidative stress and ulcerative colitis-associated carcinogenesis:studies in humans and animal models[J].Carcinogenesis 2003,24(3):353–362.

[2] Jiang XueLiang.Characteristics of 10218 Chinese UC patients[J].World Journal of Gastroenterology,2001,9(8):869-873.

[3] WANG DeQing,SHEN HongMei. Study on anti-oxidation effects of three extracts of Astragaloside[J].Chinese Pharmacological Bulletin,1994；10（2）:129-132.

[4] LIU Mei,LIU Xue Ying.Pharmacology Research Status of Matrine[J].Journal of Chinese Medicine.

[5]陈奇.中药药效研究思路与方法[M].2003,436-444