木瓜叶中齐墩果酸的提取及其羟丙基-β-环糊精包合工艺研究

所属分类：医学论文  日期：2018-08-29  浏览：次

陈秋实

手机13628671978

（武汉生物工程学院  制药工程系，湖北 武汉 430415）

摘 要 目的：选择木瓜成叶中齐墩果酸的最佳提取条件及其羟丙基-β-环糊精包合工艺。方法：采用正交实验法，以超声波处理时间、提取时间、提取温度、浸泡时间为影响因素，以齐墩果酸得率为指标优选提取工艺。然后采用正交实验法，以羟丙基-β-环糊精和齐墩果酸投料比、包合时间、包合温度为影响因素，以包合物收得率和齐墩果酸包合率的综合评分为指标，优选包合工艺。结果：最佳提取条件为超声波处理时间40 min，提取时间100 min，提取温度60 ℃，浸泡时间3h。最佳包合条件为羟丙基-β-环糊精和齐墩果酸投料比1:2，包合时间4.0 h, 包合温度60℃。结论：按照本试验方法得到较高的提取率及得到稳定的包合物。

关键词　木瓜成叶；齐墩果酸；正交实验；提取；羟丙基-β-环糊精

中图分类号：QT460.4                    文献标识码：A

 

Research of Extraction of Oleanolic Acid from leaf of Chaenomeles spciosa and Processing Techniques of Its HP-β-cyclodextrin Inclusion Compound 

CHEN Qiushi

（Department of pharmaceutical Engineering Wuhan Bioengineering Institute，Wuhan 430415，Hubei，China）

 

ABSTRACT  OBJECTIVE：Choice the best extraction of oleanolic acid from leaf of Chaenomeles spciosa and processing techniques of HP- β-yclodextrin (HP-β-CD)inclusion compound of it.  METHODS：The study was carried out with orthogonal design. time of immersion，time of extraction，temperature of extraction and time of immersion were used as indexes. The optimum including technically was chosen by determining the oleanolic acid -bearing rate．And then the effects among the proportion of HP-β-CD and oleanolic acid，the time and tempreaure in the inclusion compound were used as indexes. RESULTS：The optimal process for oleanolic acid extraction was that the time of immersion is 40 min, time of extraction is 100min, temperature of extraction is 60 ℃, time of immersion is 3h．The optimal processing conditions for (HP-β-CD) inclusion compound of oleanolic acid were: the proportion of HP-β-CD and oleanolic acid being 1:2，the inclusion compound being stirred for4.0hours at 60℃. CONCLUSION：This method can improve the extraction of oleanolic acid and increase the stability of preprations．

KEY WORDS　 leaf of Chaenomeles spciosa；oleanolic acid；orthogonal test；extraction; HP-β-CD 

CLC number: QT460.4

药用木瓜为蔷薇科（Rosaceae）植物贴梗海棠Chaenomeles speciosa(Sweet)Nakai的干燥近成熟果实^[1]。国内外研究证明，木瓜叶中含有齐墩果酸。齐墩果酸 (C₃₀H₄₈O₃) 为齐墩果酸烷型五环三萜类化合物， 化学名为(3β) - 3 - Hydroxyolean - 12 - en - 28 - oic acid^[2]。它是白色簇状针晶，无色，无味，无臭，熔点为310 ℃ ，不溶于水，可溶于甲醇、乙醇、乙醚、丙酮和氯仿等^[3]，比旋度[α] + 79.5°(氯仿中) ^[4]。齐墩果酸是治疗急性黄疸型肝炎、慢性病毒性肝炎、慢性迁延型肝炎及慢性活动型肝炎的理想药物。它具有消炎抑菌、降转氨酶、降糖、降血脂、抗血栓形成、抗突变、抗艾滋病、抑制HIV-1的复制等作用^[5]。目前，木瓜的果实和花都得到了利用，但是木瓜的叶子还没得到有效的利用。若能将木瓜叶中的齐墩果酸提取出来，就能变废为宝，让木瓜叶成为一种资源。

    本试验研究木瓜成叶中齐墩果酸的最佳提取条件。采用正交实验法，以超声波处理时间、提取时间、提取温度、浸泡时间为影响因素，以齐墩果酸得率为指标优选提取工艺。以前的文章中，很少在加热提取前用超声波处理，本文在这方面作了一定的研究。

    齐墩果酸具有强疏水性，其片剂生物利用度低。但是,如果将其做成羟丙基-β-环糊精包合物后，其理化特性明显改变，能增加药物的水溶性，提高生物利用度。羟丙基-β-环糊精(HP-β-CD)是一种具有广阔前景的优良药用载体，它不仅水溶性高(75 g·100mL )，对热稳定，且对肾无毒，对肌肉和粘膜几乎无刺激。杨彩琴^[6]等人研究了羟丙基-β-环糊精对齐墩果酸的增溶效果，由实验结果表明羟丙基-β-环糊精对齐墩果酸有较好的增溶作用，有应用前景。本实验研究了羟丙基-β-环糊精包合齐墩果酸的工艺，而且用正交试验法将包合工艺进行了优化，得到了较好的包合工艺。以往文章多用包合率为指标，本文用包合物收得率和齐墩果酸包合率的综合评分为指标优选包合工艺，将会使实验结果更准确。

湖北省境内长阳土家族自治县连片发展木瓜园，其产量占到全国同类产品的70%以上。若能对木瓜叶进行利用，既能充分利用资源，又能提高当地农民的收入。

1　材料

1.1　仪器

    HHS-4S型恒温水浴锅（上海光地仪器设备有限公司）；SK220H超声波清洗器（上海科导超声仪器有限公司）；真空干燥箱（上海实验仪器总厂）；FW177中草药万能粉碎机（天津市泰斯特仪器有限公司）；高效液相色谱仪LC-10AT泵和SPD-10A紫外检测器(日本岛律公司)；电子天平(北京赛多利斯仪器系统有限公司)；架盘药物天平（上海医用激光仪器厂，马头牌JYT-5型）；CR21型冷冻离心机（日本日立公司）；RE-52AAB旋转蒸发仪(上海嘉鹏科技有限公司)；HZ-D型循环水真空泵（巩义市予华仪器有限责任公司）；恒温磁力搅拌器（85-2型，金坛市大地自动化仪器厂）。

1.2　试药

    木瓜叶（产地湖北，长阳土家族自治县木瓜园）；齐墩果酸对照品(中国药品生物制品检定所); 甲醇为色谱纯；水为纯净水；其它试剂均为分析纯。

2　方法和结果

2.1 木瓜叶中齐墩果酸提取工艺研究

2.1.1齐墩果酸的提取

由李才国等^[7]关于齐墩果酸提取方法的研究中得知, 将回流法、索氏提取法和冷浸法三种方法比较, 回流提取法的效果最好。本试验采用回流提取法对木瓜叶中的齐墩果酸进行提取。

    将木瓜成叶在60 ℃下真空烘干，然后用中草药万能粉碎机粉碎。精确称取木瓜成叶粗粉50 g，加入一定量95％乙醇，先浸泡一段时间,再用超声波处理一段时间。处理完后，将木瓜成叶和乙醇一起倒入圆底烧瓶中，在一定温度下，回流提取一段时间。

2.1.2 齐墩果酸的分离纯化

    将回流提取液放入到旋转蒸发仪进行浓缩得到浸膏。将浸膏状物质先后用水和氯仿洗涤，合并洗涤液，去水层。将有机层用水洗涤6次，将水层去掉，蒸馏氯仿后得齐墩果酸。

2.1.3 TCL分析

取齐墩果酸对照品和由上述方法分离得到的齐墩果酸，分别加乙醇溶解配成1.5 mg/ml的溶液。取一定量对照品溶液及样品溶液，分别点在自制的硅胶薄层G板上，然后分别以乙酸乙酯-石油醚(1:3)及氯仿-丙酮(8:2)为展开剂展开。取出挥去溶剂，喷5％磷钼酸乙醇溶液显色后，于105 ℃加热至斑点清晰(约5 min)。结果表明，在两种不同的展开系统下，样品与齐墩果酸对照品具有相同的R_f值，并呈现相同的蓝色斑点。

    说明木瓜成叶中含有齐墩果酸。

2.1.4 色谱条件

Phenomenex Luna C₁₈色谱柱(4.6 mm×150 mm，5 μm); 柱温30 ℃；流速1.0 ml/min；检测波长215 nm；流动相为甲醇-水-冰醋酸(88:12:0.1)。

2.1.5 对照品溶液的制备

精密称取齐墩果酸对照品10 mg，用少量甲醇溶解，再置于10 ml容量瓶，加甲醇至刻度线，溶解制成1 mg/ml的溶液。

2.1.6 线性关系考察

    将配制好的对照品溶液准确吸取0.2 ml，0.4 ml，0.6 ml, 0.8 ml , 1.0 ml, 加甲醇补充至10  ml，混合均匀，得到浓度为0.02 mg/ml，0.04 mg/ml，0.06 mg/ml，0.08 mg/ml，0.10 mg/ml的齐墩果酸标准溶液。每次取20 μl进样测定其峰面积。以齐墩果酸浓度(x)和峰面积(y)求回归方程。y=3998987x+23112，r=0.9968，结果表明齐墩果酸在0.02-0.10mg/ml与峰面积呈良好的线性关系。

2.1.7 精密度试验

精密吸取上述对照品溶液20 μl，连续进样5次，测定峰面积RSD=1.35 ％，表明进样精密度良好。

2.1.8 稳定性试验

    取同一供试样品溶液，分别于配制后0、2、4、6、8、12 h，进样20 μl，依次测定，结果表明，同一供试样品溶液在12 h内基本稳定，RSD=1.87 ％。

2.1.9 回收率试验

    准确量取5份已知含量的齐墩果酸样品溶液各1 ml，分别加入0.2 mg的齐墩果酸标准品，按样品制备方法和测试条件测定，计算回收率为97.92％，RSD=1.56％ ，说明该方法准确度较好。

2.1.10 正交试验

    经初步实验，选择超声波处理时间（A）、提取时间（B）、提取温度（C）、浸泡时间（D）为影响因素（不计交互影响），以齐墩果酸得率为评价指标，利用L₉(3⁴)正交表设计正交实验寻找最佳的提取条件。具体影响因素、实验水平表及结果见表1、表2、表3所示。

表1  齐墩果酸提取工艺因素水平

Tab 1  Factors and levels of the extraction condition of oleanolic acid

因素水平	超声波处理时间 /min	提取时间 /min	提取温度 /℃	浸泡时间 /h
1	20	80	35	1
2	40	90	50	2
3	60	100	60	3

2.1.11 齐墩果酸的提取及纯化

    按照2.1.1中齐墩果酸的提取工艺所表述的方法，根据将表1中的数据进行提取。然后再用2.1.2中的分离纯化的方法将每组样品进行纯化。得到的齐墩果酸用甲醇定容到100 ml。

 

表2   齐墩果酸提取工艺正交试验结果

Tab 2 Orthogonal test of the extraction condition of oleanolic acid

实验号	影响因素				齐墩果酸得率（%）
	A	B	C	D
1	1	1	1	1	0.22
2	1	2	2	2	0.59
3	1	3	3	3	0.81
4	2	1	2	3	0.79
5	2	2	3	1	1.08
6	2	3	1	2	1.02
7	3	1	3	2	0.49
8	3	2	1	3	0.73
9	3	3	2	1	0.76
Ⅰj	0.54	0.50	0.66	0.69
Ⅱj	0.96	0.80	0.71	0.70
Ⅲj	0.66	0.86	0.79	0.78
R	0.42	0.36	0.13	0.09

表3   齐墩果酸提取工艺方差分析结果

Tab 3  Results of variance analysis of the extraction condition of oleanolic acid

误差来源	离差平方和	自由度	方差	Ｆ值	显著性
A	0.2856	2	0.1428	20.18	P<0.05
B	0.2260	2	0.1130	15.97
C	0.0283	2	0.0141	2.00
D	0.0142	2	0.0071	1.00
误差	0.0142	2	0.0071	1.00

注：因为D因素影响较小，所以将D因素作为方差分析中的误差项来处理

F_0.05(2,2)=19.0；F_0.01(2,2)=99.00；

2.1.12 结果分析

    比较表2中各因素的级差值(R)的大小，可以看出各因素对提取效果影响的主次顺序为：A＞B＞C＞D。比较表2中每个因素在3个水平下实验指标的平均值Ⅰ_j，Ⅱ_j，Ⅲ_j的大小顺序得到水平优势为A₂＞A₃＞A₁，B₃＞B₂＞B₁，C₃＞C₂＞C₁，D₃＞D₂＞D₁。

确定最佳工艺条件：由正交实验选出齐墩果酸提取工艺条件为A₂B₃C₃D₃，即超声波处理时间为40 min，提取时间为100min，提取温度为60 ℃，浸泡时间为3h。

从表3方差分析，由于因素A(超声波处理时间)的F值为20.18比19.00大，即p小于0.05，所以因素A各水平间有显著性影响；提取时间（B）、提取温度（C）、浸泡时间（D）的F值都小于19.0，所以他们的p都大于0.05。由此得出结论这三个因素各水平间都无显著性差异。

2.1.13 验证实验

对最佳工艺进行验证，按所选的最佳提取工艺条件进行实验。结果齐墩果酸的得率为2.98％，高于正交实验的各实验结果。结果证实最佳工艺可行。

2.2 羟丙基-β-环糊精包合物制备工艺研究

2.2.1 实验步骤

2.2.1.1 包合物的制备：

称取羟丙基-β-环糊精（经50 ℃干燥1.5 h）5.00 g放入锥形瓶中，然后加入10.00 mL蒸馏水并加热(30 ℃)溶解。再按表4中的条件称取一定量的齐墩果酸,并将其溶解在300 mL乙醇中。在一定温度下将齐墩果酸的乙醇溶液缓缓加入羟丙基-β-环糊精的水溶液中，搅拌包合一定的时间，静置（冷藏24 h），抽滤。在干燥箱内40 ℃干燥1 h，即得。

2.2.1.2 包合物的综合评分：

产品中齐墩果酸的总量的测定：准确称取0.1 g左右产品，加水25 mL形成均一体系，准确移取10 mL，加入氯仿反复提取至下层无色。蒸馏氯仿，将得到的齐墩果酸用少量甲醇溶解，再置于10 ml容量瓶，加甲醇至刻度线。

产品表面齐墩果酸的测定：准确称取0.2 g左右产品，放入离心管中，加入20 mL正己烷，剧烈震荡l min左右。在6000 r/min，4 ℃条件下离心5 min。取上清液，用氮气吹干，然后用少量甲醇溶解，再置于10 ml容量瓶，加甲醇至刻度线。

包合物中齐墩果酸的量=产品中齐墩果酸的总量-产品表面齐墩果酸的量

包合物收率％=包合物质量（g）/[齐墩果酸重量（g）+羟丙基-β-环糊精重量（g）]×100%

齐墩果酸包合率％=包合物中齐墩果酸的量（g）/[齐墩果酸投入量（g）×空白回收率] ×100％

综合评分＝包合物收率％×30％＋齐墩果酸包合率％×70％

2.2.1.3齐墩果酸回收率的测定：

    精密量取齐墩果酸溶液一定体积，加入等物质的量的羟丙基-β-环糊精，用20 mL氯仿分3次萃取，合并氯仿溶液。蒸馏氯仿，将得到的齐墩果酸用少量甲醇溶解，再置于10 ml容量瓶，加甲醇至刻度线。空白回收率=实际测得齐墩果酸的量（g）／齐墩果酸的投入量（g）×100％

2.2.1.4正交实验

经初步试验，选定羟丙基-β-环糊精和齐墩果酸投料比（A）、包合时间（B）、包合温度（C）为影响因素（不计交互影响），以包合物收得率和齐墩果酸包合率的综合评分为指标，利用L₉(3⁴)正交表设计正交试验寻找最佳的提取条件。具体影响因素、实验水平及结果见表4、表5、表6所示。

表4   齐墩果酸羟丙基-β-环糊精包合工艺中各因素水平表

Tab 4 factors and levels of inclusion condition of oleanolic acid

因素水平	羟丙基-β-环糊精: 齐墩果酸 / 摩尔比	包合时间 / h	包合温度 / ℃
1	1:1	2.0	50
2	1:2	3.0	60
3	1:3	4.0	70

表5   L₉(3⁴)正交试验结果及数据处理结果

Tab 5 orthogonal test of the inclusion condition of oleanolic acid

实验号	影响因素				收率 （％）	包合率（％）	综合评分
	A	B	C	D(空白)
1	1	1	1	1	41.97	30.57	40.93
2	1	2	2	2	65.08	51.38	45.25
3	1	3	3	3	65.88	50.68	52.71
4	2	1	2	3	63.89	49.67	43.51
5	2	2	3	1	64.79	51.65	65.22
6	2	3	1	2	82.41	57.37	65.32
7	3	1	3	2	56.97	39.67	46.32
8	3	2	1	3	69.15	57.39	53.27
9	3	3	2	1	64.36	49.38	67.32
Ⅰj	50.93	47.12	56.48	50.45
Ⅱj	61.63	59.91	57.29	58.81
Ⅲj	56.15	61.68	54.94	59.44
R	10.70	14.56	2.35	8.99

表6   齐墩果酸羟丙基-β-环糊精包合工艺的方差分析

Tab 6  variance analysis of the inclusion condition of oleanolic acid

误差来源	离差平方和	自由度	方差	Ｆ值	显著性
A	171.87	2	85.94	20.06	P<0.05
B	378.45	2	189.23	44.18	P<0.05
C	8.57	2	4.28	1.00
误差	8.57	2	4.28	1.00

注：因为C因素影响较小，所以将C因素作为方差分析中的误差项来处理

　F_0.05(2,2)=19.0；F_0.01(2,2)=99.00；

    比较表5中各因素的级差值(R)的大小，可以看出各因素对提取效果影响的主次顺序为：

B＞A＞C。比较表5中每个因素在3个水平下实验指标的平均值Ⅰ_j，Ⅱ_j，Ⅲ_j的大小顺序得到水平优势为A₂＞A₃＞A₁，B₃＞B₂＞B₁，C₂＞C₁＞C₃。

    确定最佳工艺条件：由正交实验选出齐墩果酸羟丙基-β-环糊精包合工艺条件为A₂B₃C₂，即羟丙基-β-环糊精和齐墩果酸投料比为1:2，包合时间为4.0 h，包合温度为60℃。

从表6方差分析，由于因素A(羟丙基-β-环糊精和齐墩果酸投料比)的F值为20.06比19.00大，即p小于0.05；因素B(包合时间) 的F值为44.18比19.00大，即p小于0.05。所以因素A(羟丙基-β-环糊精和齐墩果酸投料比) 和因素B(包合时间)各水平间有显著性差异。因素C(包合温度)的F值为1.00比19.00小，即p大于0.05。所以因素C(包合温度)各水平间无显著性差异。

2.2.1.5验证实验

对优选出的最佳工艺A₂B₃C₂做验证实验，结果包合率为59.23％，收率为83.45％。可见包合率高于正交实验各结果，收得率与正交实验各结果相比也有较高水平，因此最佳包合工艺可行。

2.2.1.6薄层色谱验证

将包合物准确称取0.5 g左右产品，加水100 mL形成均一体系，准确移取50 mL，加入氯仿反复提取至下层无色。蒸馏氯仿，将得到齐墩果酸。用乙醇溶解配成1.5 mg/ml的溶液。然后取齐墩果酸对照品，也配成1.5 mg/ml的乙醇溶液。取一定量对照品溶液及样品溶液，分别点在自制的硅胶薄层G板上，然后分别以乙酸乙酯-石油醚(1:3)及氯仿-丙酮(8:2)为展开剂展开。取出挥去溶剂，喷5％磷钼酸乙醇溶液显色后，于105 ℃加热至斑点清晰(约5 min)。结果表明，在两种不同的展开系统下，样品与齐墩果酸对照品具有相同的R_f值，并呈现相同的蓝色斑点。结果表明包合前、后齐墩果酸未被破坏，所以包合物质量较好，包合过程对齐墩果酸成分无影响。

3　讨论

3.1 确定最佳工艺条件：

    由正交试验选出齐墩果酸提取工艺条件为A₂B₃C₃D₃，即超声波处理时间为40 min，提取时间为100 min，提取温度为60 ℃，浸泡时间为3h。

    由正交试验选出齐墩果酸羟丙基-β-环糊精包合工艺条件为A₂B₃C₂，即羟丙基-β-环糊精和齐墩果酸投料比为1:2，包合时间为4.0 h, 包合温度为60 ℃。

3.2 本试验选择的提取溶剂是95％乙醇。除了乙醇外，齐墩果酸还能溶于甲醇、苯、乙醚、丙酮和氯仿等溶剂,但是工业酒精价廉、安全、易得，适合工业化生产用，所以本实验选用95％乙醇作为溶剂。

3.3 在提取温度的选择上，应该考虑所用溶剂的沸点。本实验选择的是乙醇，所以所选温度不能超过乙醇的沸点，否则在提取过程中，会有大量溶剂挥发。而且如果沸腾过于剧烈，可能导致爆炸。提取温度也不能选择得太低，否则提取效果不好。

3.4本试验采用饱和水溶液法进行包合，操作方便，设备要求不高，便于工业化生产。

参考文献：

[1] 李家实．中药鉴定学[M]．上海．上海科学技术出版社，2002：387.

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[3] 王德仁．齐墩果酸研究新进展[J]．天津药学，2003，15(3)：56-58.

[4] 王立新, 韩广轩, 刘文庸, 等. 齐墩果酸的化学药理研究[J]．药学实践杂志,2001 ,19 (2): 104.

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[6] 杨彩琴， 丁里玉， 林玉龙,等. 相溶解度法研究羟丙基-β-环糊精对齐墩果酸的增溶效果[J]．中成药，2005，27(8)：888-889.

[7] 李才国, 刘 睿. 木瓜中齐墩果酸的提取、分离及鉴定[J]. 现代商贸工业, 2007, 19(3): 159-161.

 

 

齐墩果酸提取液色普图

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