张嫣 陈伟忠 施杰民

【摘要】 目的  探讨雌激素受体α（ERα）基因多态性对熊去脱氧胆酸(Ursodeoxycholic acid，UDCA)治疗女性原发性胆汁淤积性肝硬化(primary cholestasis cirrhosis, PBC)疗效的影响。 方法  采用聚合酶链反应-限制性片段长度多态性方法检测65例女性PBC患者ERα基因1号内含子PvuⅡ和XbaⅠ酶切位点多态性。患者确诊为PBC后，均给予UDCA片口服治疗，13-15mg/kg/d，分3次口服。3或6个月随访收集一次患者临床和实验室生化指标，随访观察24个月。失随访5例患者。生化指标包括血清总胆红素(Tbil)、丙氨酸转氨酶(ALT)、天冬氨酸转氨酶(AST)、碱性磷酸酶(ALP)、γ-谷氨酰转肽酶(GGT)等。结果  经UDCA治疗1个月,各项指标与治疗前无显著性变化。治疗3个月，ALP、ALT、AST明显下降(p<0.05),但Tbil和GGT变化不明显。至治疗6个月时,ALT下降近一半，GGT和Tbil均明显下降(p<0.05),而ALT和AST大部分患者已降至较低水平。治疗12个月后,ALP、ALP、AST可基本恢复正常，γ-GT及Tbil亦大幅度下降。至18个月及24个月后，除GGT及Tbil稍高于正常值外,其它生化指标均维持在正常水平。PvuⅡPP、Pp、pp在UDCA治疗有效组(10.2%、36.4%、51.1%)和无效组(9.1%、36.4%、54.5%)中分布差异无统计学意义(P>0.05)；同时与XbaⅠXX、Xx、xx基因型进行比较，XX、Xx、xx在UDCA治疗有效组(4.4%、24.4%、71.2%)和无效组(6.7%、20.0%、73.3%)中差异无统计学意义(P>0.05)。同时对两基因及年龄、性别多因素Logistic回归分析发现，相对于PP或XX基因型而言，携带Pp/pp或Xx/xx基因型者对熊去脱氧胆酸的疗效会有所升高，但没有达到统计的显著性水平。 结论  UDCA治疗女性PBC患者安全有效，ERα基因不是UDCA治疗PBC的靶点基因。

    【关键词】 原发性胆汁性肝硬化    熊去脱氧胆酸    疗效    受体，雌激素    遗传多态性    

    原发性胆汁性肝硬化(primary biliary cirrhosis，PBC)的发病除免疫因素外，还被认为与雌激素及其受体密切相关^［1］，这有助于解释女性患者在PBC发病中占据绝对多数的原因^［2］。尽管熊去脱氧胆酸［3α，7β二羟基-5β-胆(甾)烷酸，Ursodeoxycholic acid，UDCA］是目前较为公认的治疗PBC的药物，但最近一项随机临床试验的荟萃分析^［3］并未显示UDCA治疗对改善PBC患者的死亡率或肝移植率有益处。我们的临床经验也表明，UDCA并不对每一位PBC患者都有效。为此，我们对女性PBC患者的雌激素α受体（ERα）基因多态性进行了研究，以探讨ERα基因多态性对UDCA治疗女性PBC疗效的影响。

资料与方法

1． 临床资料：

作者单位  200070 上海市闸北区中心医院综合内科（张嫣）；第二军医大学附属长征医院消化内科（陈伟忠）；浙江省湖州市中心医院消化内科（施杰民）

通讯作者  陈伟忠

2005年6月至2008年6月门诊及病房收治女性PBC患者65例，年龄43～79岁，平均年龄57.2

±11.4岁。病毒性肝炎指标均为阴性，其中5例行肝组织学活检，经病理证实均显示肝内小胆管损伤和炎症。患者均有肝功能异常，第一次采血前均未用熊去氧胆酸(UDCA)、过糖皮质激素类及其他免疫抑制和(或)增强剂等药物治疗。

2.疾病标准：

（1）诊断标准：①血清碱性磷酸酶(AKP)等反映胆汁淤积的生化指标升高超过正常值的2倍；②通过腹部B超或CT等检查排除其他胆道梗阻因素；③血清抗线粒体抗体(AMA)或AMA-M2亚型阳性；④AMA/AMA-M2阴性者，B超或肝穿刺病理检查符合PBC改变。

（2）排除标准：肝外胆管梗阻及其他肝病如病毒性肝炎(甲、乙、丙、丁、戊型肝炎)、酒精性肝病、α₁-抗胰蛋白酶缺乏症、自身免疫性肝炎、原发性硬化性胆管炎；肝硬化失代偿(child分级B/C)；Mayo危险度积分预计存活期不超过1年者；合并其他自身免疫病,如干燥综合征(SS)、系统性红斑狼疮(SLE)等以及其他心、肺、血液并发症和身体状况较差者。

（3）疗效标准：疾病进展或复发均视为药物治疗无效。判断标准：①研究期间血清总胆红素升高至正常值2倍以上，出现肝硬化失代偿的表现为疾病进展。②ALP、GGT、总胆红素等肝功能指标高于正常值1.5倍为疾病复发。

3.观察指标：

观察期间，每3或6个月重复检查记录PBC患者的临床症状，应用贝克曼全自动生化仪和配套试剂检测血清总胆红素(Tbil)、丙氨酸转氨酶(ALT)、天冬氨酸转氨酶(AST)、碱性磷酸酶(ALP)、γ-谷氨酰转肽酶(GGT)等生化指标。

5.临床用药：

65例女性患者确诊为PBC后，均给予UDCA片口服治疗，使用的UDCA为德国福克大药厂生产，商品名为优思弗，250mg/粒。剂量及用法为13-15mg/kg/d，每天3次口服。每2月随访收集一次患者临床和实验室资料，随访观察24个月。随访期间持续规则用药，若出现严重药物不良反应或疾病进展则停药。患者根据肝功情况辅以保肝降酶退黄支持综合治疗。肝硬化失代偿患者间断对症给予白蛋白、血浆行综合基础治疗。UDCA治疗过程中，5例患者失随访。

6.实验方法

ERα基因型的鉴定：取EDTA抗凝的外周血4ml，采用可以特异性结合DNA的离心吸附柱和独特的缓冲液系统，提取血液中的基因组DNA。PCR扩增ERa基因第一内含子和第二外显子的一部分产物。设计引物序列，上游：5’CTGCCACCCTATCTGTATCTTTTCCTATTCTCC-3’,下游：5’–TCTTTCTCTGCCACCCTGGCGTCGATTATCTGA-3’。PCR反应体系：基因组DNA0.1μg/L，10mmol/L Tris-HCL、50mmol/L KCL、2mmol/L MgCl₂、200μmoll/L dNTP、2μmol/L引物。PCR反应条件：95℃预变性7min，94℃变性30S，6℃退火40S，72℃，延伸90S，35个循环，循环结束后72℃延伸10min。扩增产物在含0.5mg/L溴化乙锭(EB)的1%琼脂糖凝胶中以110V稳压电泳15min,紫外检测仪观察结果,扩增产物长1.3kb。MarkerDL-2000(Takara)。

限制性内切酶XbaⅠ和PvuⅡ分别对PCR产物进行酶切,酶切产物在含0.5mg/LEB的1%琼脂糖凝胶中以110V稳压电泳30min,紫外检测仪观察结果。

7.统计学处理：

采用SPSS13.0软件包，基因型和等位基因频率采用直接基因计数法计算，并进行Hardy-Wein berg遗传平衡检验，统计学方法为Chi-square及t检验，两组间计量资料采用t或t’检验，用x±s表示，资料不符合正态分布的，进行资料转换后再进行统计。计数资料间的比较采用x2检验，部分采用Fisher精确概率法。p<0.05为差异有统计学意义。OR值和95％可信区间(95％CI)通过非条件Logistic回归模型拟合进行分析。

结  果

1.ERα基因型的多态性：检测ERα的扩增产物为1.3kb。XbaⅠ酶切后出现3种基因型(图1)：缺乏XbaⅠ酶切位点为XX型(1.3kb1条带)条带，杂合子为Xx型(1.3kb,910kb和390bp3带)，存在XbaⅠ酶切位点为xx型(910bp和3902条带)；PvuⅡ酶切后出现3种基因型(图2)：缺乏PvuⅡ酶切位点为PP型(1.3kb1条带);杂合子为Pp（1.3kb,850bp和450bp3条带），存在PvuⅡ酶切位点为pp型(850bp和450bp2条带)。根据电泳图判断并记录个体的基因型，x²检验女性PBC

图1.ERα基因多态性1%琼脂糖凝胶电泳图谱   图2.ERα基因多态性1%琼脂糖凝胶P电泳图谱

1:xx基因型；2:Xx基因型；3:XX基因型       5:pp基因型；6:Pp基因型；7:PP基因型

M（Marker）: DNA分子量标志               M（Marker）: DNA分子量标志

患者在XbaⅠ和PvuⅡ的基因型及等位基因频率分布符合Hardy-Weinberg遗传平衡定律(P>0.05)。女性PBC患者的ERαXXPP基因型，1例，占1.7%；XXPp基因型，1例，1.7%；XxPP基因型，1例，1.7；XxPp基因型，8例，13.3%； Xxpp基因型，1例，1.7%；xxPP基因型3例，5%；xxPp基因型，9例，15%；Xxpp基因型，36例，60%。未发现XXpp基因型患者。

2.UDCA治疗后患者临床和生化指标的变化

患者经6个月以上的治疗后，自觉乏力、皮肤搔痒、黄疸等症状均逐渐减轻或消失，35例肝脾肿大也不同程度减轻，8例腹水消失。患者PBC患者主要以胆汁淤积的生化指标ALT、GGT增高为主,同时伴有肝实质损伤指标AST、ALT的增高,Tbil除少数患者外轻度升高。经UDCA治疗1个月,各项指标与治疗前无显著性变化，治疗3个月，ALP、ALT、AST明显下降(p<0.05),但Tbil和GGT变化不明显。至治疗6个月时,ALT下降近一半，GGT和Tbil均明显下降(p<0.05),而ALT和AST大部分患者已降至较低水平。治疗12个月后,ALP、ALP、AST可基本恢复正常，γ-GT及Tbil亦大幅度下降。至18个月及24个月后，除GGT及Tbil稍高于正常值外,其它生化指标均维持在正常水平。见表1.

表1.  PBC患者治疗前后主要生化指标的变化情况（n=60,x+s）

注：（1）0月为治疗开始；（2）^*p<0.05;^**p<0.051

3.ERα基因型与熊去脱氧胆酸疗效的关系

治疗前及后24周对65例PBC病人的临床及实验室指标进行检查，并按疗效标准评价疗效，失访者5例，有完整临床资料60例，进行以下分析。其中治疗有效者45例，无效者15例，有效率75.0％。将以上两组数据与PvuⅡPP、Pp、pp基因型进行比较，结果表明，PvuⅡPP、Pp、pp在UDCA治疗有效组(10.2%、36.4%、51.1%)和无效组(9.1%、36.4%、54.5%)中分布差异无统计学意义(P>0.05)；同时与XbaⅠXX、Xx、xx基因型进行比较，结果表明，XX、Xx、xx在UDCA治疗有效组(4.4%、24.4%、71.2%)和无效组(6.7%、20.0%、73.3%)中差异无统计学意义(P>0.05)。同时对两基因及年龄、性别多因素Logistic回归分析发现，相对于PP或XX基因型而言，携带Pp/pp或Xx/xx基因型者对熊去脱氧胆酸的疗效会有所升高，但没有达到统计的显著性水平。见表2.

表2.  ERα基因型与熊去脱氧胆酸疗效的关系

讨  论

PBC是一种好发于中年女性的自身免疫性病变，其病理特征是慢性进行性肝内小叶间胆管和中隔胆管的非化脓性炎性破坏及淋巴肉芽肿^［4］。其自然进程约20年，自出现症状至死于肝功能衰竭或食管静脉曲张破裂约10年。治疗原则包括对症处理、免疫调节、消炎利胆和抗纤维化及肝移植。其中，UDCA是当今公认的治疗PBC的主要药物。UDCA是黑熊胆汁酸的主要成分，在传统中医中用于治疗各种肝病。近年来，UDCA越来越多地用于治疗各种胆汁淤积性疾病。UDCA的肝毒性较内源性胆汁酸低，本身即存在于人体胆汁中，但仅占总胆汁酸的3％。患者服药后，UDCA通过与内源性胆汁酸竞争，在回肠末端被人体吸收，最终成为体内主要的胆汁酸，占胆汁酸池总量的40％-50％。UDCA对PBC的作用机制是多方面的。

胆汁中UDCA含量增加可提高胆汁的亲水性，减少其细胞毒性。动物实验显示^［5］UDCA可减轻胆管细胞损伤，改善汇管区炎症和肝小管增生。胆汁形成障碍和各种胆道阻塞性疾病可致胆汁酸和其他具有潜在毒性的胆汁成分在肝内潴留。UDCA可刺激胆道分泌胆汁酸和其他有机阴离子，如胆红索葡糖苷酸和谷胱甘肽轭合物，防止疏水性胆汁酸所致的胆汁淤积。胆汁酸浓度为25mmol/L时即可诱导肝细胞凋亡。Rodrigues等^［6］认为UDCA系通过干扰经典凋亡途径以抑制凋亡。Qiao等^［7］还发现UDCA可激活表皮生长因子受体(EGFR)活化细胞内丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)通路以抑制凋亡。UDCA还可减少炎性细胞因子的产生、保护细胞膜以及减少异常人类白细胞抗原(HLA)表达，从而对PBC起治疗作用。

UDCA治疗PBC在临床上已取得一些疗效并积累了一定的治疗经验。美国肝病研究协会制定的PBC处理指南^［8］认为伴肝脏生化异常的PBC患者应每天服用13-15mg/kgUDCA。可分次或单次服用。我们采用每天13-15mg/kg分次服用UDCA治疗PBC也取得了75%的有效率，但仍有25%的PBC患者虽经UDCA治疗却疗效欠佳，疾病进展或复发。Yan^［9］认为，UDCA治疗PBC的作用靶分子和作用途径至今未明，故对其疗效的判定仍存在很大争议。不同的个体对同一种药物有不同的反应，这其实一直是困扰临床治疗的一个重大问题。随着药物基因组学的发展，现在认为药物代谢酶、转运蛋白、受体和其他药物作用靶点的基因多态性是引起药物效应和毒性个体差异的重要原因。

UDCA作为治疗PBC药物中应用最多的改善病情的主要常用药物^［10］，受到药物基因组学研究的关注^［11］。PBC患者90％以上见于女性，且多见于中老年妇女，无儿童患者。因此，PBC的发病除免疫因素外，还应与内分泌等因素密切相关^［12］。在PBC的众多致病因素中，雌激素及其受体被认为与PBC的发生有一定的相关性^［1］。ER基因可作为雌激素相关疾病的候选易感或致病基因^［13］ERα基因在1号内含子中有两处点突变，这两处点突变发生在限制性内切酶PvuⅡ和XbaI的识别位点上，其中PvuⅡ是T／C置换，XbaI是G／A置换。编码ER基因的遗传多态性是靶器官上ER的表达和功能有个体差异的原因，这也是导致不同个体对对同一种药物有不同的反应的重要原因^［14］。

    但本研究结果表明，ERαPvuⅡPP、Pp、pp和ERαXbaⅠXX、Xx、xx各基因型在UDCA治疗有效组和无效组中分布差异并无显著性。对两基因及年龄、性别多因素Logistic回归分析后发现，相对于PP或XX基因型而言，携带Pp/pp或Xx/xx基因型者对UDCA的疗效会有所升高，但也没有达到统计的显著性水平。我们认为，ERα基因并不是UDCA治疗PBC的靶点基因，尽管已有研究^［1］认为PBC的病程进展与ERα的低表达密切相关。由于我们研究的样本数量有限，未能进行更深的分层研究。每项研究样本量多少的不同，对于研究的结果会有较大的影响，我们的研究结论还有待临床作出进一步大样本的多中心的协同研究。

参考文献

1.Alvaro D, Invernizzi P, Onori P, et al. Estrogen receptors in cholangiocytes and the progression of primary biliary cirrhosis. J Hepatol,2004,41(6):905-12.

2.Gershwin ME, Selmi C, Worman HJ, et al. Risk factors and comorbidities in primary biliary cirrhosis: a controlled interview-based study of 1032 patients. Hepatology, 2005,42(5):1194-202.

3.Gong Y，Huang Z，Christensen E，et a1．Ursodeoxycholic acid for patients with primary biliary cirrhosis：an updated systematic review and meta-analysis of randomized clinical trials using Bayesian approach as sensitivity analyses．Am J Gastroenterol，2007，102(8)：1799-1807．

4.Drebber U, Mueller JJ, Klein E,et al. Liver biopsy in primary biliary cirrhosis: clinicopathological data and stage. Pathol Int,2009,59(8):546-54.

5.Van Nieuwkerk CM，Elferink RP,Groon AK，et a1．Effects of Ursodeoxycholate and cholate feeding on liver disease in FVB mice with a disrupted mdr2 pglycoprotein gene．Gastrocntemlogy，1996，111(1)：165-171．

6.Rodrignes CM，Steer cJ． Mitoehondrial membrane perturbations in cholestasis．J Hepatol，2000,32(1)：135．141．

7.Qiao L， Yacoub A，Studer E，et a1．Inhibition of the MAPK and P13K pathways enhances UDCA-induced apoptesis in primary rodent hepatocytes．Hepatology，2002，35(4)：779-789．

8.Heathcote EJ．Management of primary biliary cirrhosis．The American Association for the Study of Liver Diseases practice guidelines．Hepatology，2000，31(4)：1005-

1013．

9.Yan G，Erik C．Ghud C．11le long·term beneficial effects of ursodooxycholic acid in primary biliary cirrhosis are highly questionable．Am J Gastroenterol，2007，102(2)：464-465．

10.Poupon R, Ping C, Chrétien Y,et al. Genetic factors of susceptibility and of severity in primary biliary cirrhosis. J Hepatol,2008,49(6):1038-45.

11.Corpechot C, Benlian P, Barbu V, et al.Apolipoprotein E polymorphism, a marker of disease severity in primary biliary cirrhosis? Hepatol,2001 Sep;35(3):324-8.

12.Silveira MG, Mendes FD, Diehl NN, et al. Thyroid dysfunction in primary biliary cirrhosis, primary sclerosing cholangitis and non-alcoholic fatty liver disease. Liver Int, 2009,29(7):1094-100.

13.Kobayashi S，Inoue S，Hosoi T，et a1．Association of bone mineral density with polymorphism of the estrogen receptor gene．J Bone Miner Res，1996，11(3)：306-311．

14.Massart F. Human races and pharmacogenomics of effective bone treatments. Gynecol Endocrinol，2005，20(1):36-44.