m

【摘要】 目的：观察蟾蜍灵对PDGF诱导的系膜细胞(mesangial cell ,MC)PAI-1、u-PA、t-PA的表达影响，探讨其对系膜细胞纤溶酶原/纤溶酶系统的作用。方法：PDGF (20ng/ml/)刺激体外培养的系膜细胞12小时后，加入0.08μM蟾蜍灵干预12小时，用发光底物显色法检测细胞上清培养液中PAI-1的活性；RT-PCR法测定PAI-1、u-PA、t-PA基因表达变化。结果：PDGF可诱导MC中PAI-1的mRNA表达上调,并且活性增加， u-PA、t-PA mRNA转录下调；0.08UM蟾蜍灵可下调PDGF诱导的系膜细胞的PAI-1 mRNA，上调u-PA、t-PA mRNA的转录，并抑制 PAI-1的活性。0.08μM蟾蜍灵对正常系膜细胞无明显影响（P>0.0.5）。结论：蟾蜍灵可通过促进细胞外基质降解来抑制PDGF诱导的肾小球硬化。

【关键词】 蟾蜍灵 系膜细胞 PAI-1  u-PA  t- PA

The effect of bufalin on plasminogen system in PDGF-induced mesangial cell 

[Abstract] 　

Objective : To investigate the role of plaminogen activator inhibitor-1(PAI-1),u-PA,t-PA in the regulation of bufalin on plasminogen system stimulated by platelet-derived growth fator-BB(PDGF-BB) in mesangial cell.

Methods : The cultured rat mesangial cells were stimulated with PDGF for 12 hours ,and then 0.08μM  bufalin were added into the supernatants for 12hours. The activity of PAI-1 in cultured supernatants was determined by spectrophotoetric methods.The expression of PAI-1, ,u-PA,t-PA was assayed by semi-quantitative PCR.

Results: 20g/ml PDGF-BB increased significantly the expression of PAI-1 mRNA and the

activity of PAI-1 than that of the control(p<0.05), whereas u-PA,t-PA mRNA transcription was reduced(p<0.05); intervention of 0.08μM bufalin for 12 hours could reverse PDGF-BB-induced up-regulation of PAI-1, the activity of PAI-1 and increase the expression of u-PA,t-PA mRNA. (p<0.05).  However, 0.08μM bufalin displayed no significant change on normal mesangial cell(p>0.05).

Conclusion: Bufalin may inhibit the PDGF-BB-induced glomerular sclerosis by increasing the degradation of extracellular matrix..

[Key words] bufalin  mesangial cell  PAI-1  u-PA  t-PA

蟾蜍灵是中药蟾酥中提取的毒性配基之一。目前关于蟾蜍灵的研究主要集中在其抗癌作用上^[1,2]。我们前期研究已经报道，蟾蜍灵同样也可以抑制系膜细胞的异常增殖^[3]。但关于蟾蜍灵在抗肾脏纤维化中作用方面国内外还未见报道。本研究观察了蟾蜍灵对PDGF诱导的系膜细胞纤溶酶原/纤溶酶系统的作用，为寻求防治肾脏纤维化的临床有效药物提供实验依据。

1 材料和方法

1．1 材料

大鼠系膜细胞株HBZY-1 （中国典型培养物保藏中心），蟾蜍灵、PDGF（Sigma 公司，美国），胎牛血清（杭州四季青），低糖DMEM 培养基（Gibco 公司，美国），DNA Marker （），TRIzol Reagent（Invitrogen 公司，美国），蛋白Marker、Taq DNA polymerase（TaKaRa公司，日本），AMV、RNase Inhibitor （promega公司，美国）。

1．2 方法

1．2．1 细胞培养与分组

GMC 常规培养于含有10％胎牛血清的DMEM培养液（含100 U ／ml 青霉素，100 μg ／ml 链霉素）中，置于37℃、5％ CO2培养箱中培养，每2 天换液，当系膜细胞长至贴壁80％～90％ 时，PBS 液洗2 次，25 mg ／ L 胰蛋白酶消化细胞、传代，实验选第4～8代对数生长期细胞。

1．2．2逆转录聚合酶链反应

用磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤各组细胞3 次，每孔中加入1 ml TRIzol RNA 提取液，按说明书步骤提取总RNA， 用紫外分光光度仪测260 nm、280 nm 的吸光度值，重复3 次，计算A260 ／A280的比值。根据A260的值计算RNA 浓度， 将RNA 逆转录为cDNA 后进行循环扩增，总反应体系为50μl。反应条件为：94℃，5 min 预变性；94℃，30 s 变性； 相应退火温度40 s退火；72℃，30 s 延伸；循环相应次数；72℃终末延伸5 min。聚合酶链反应引物由美国Invitrogen 公司上海分公司合成。

PCR 产物经15 g ／ L 琼脂糖凝胶电泳、凝胶图像扫描系统成像并进行灰度扫描， 以密度代表其表达量，用GAPDH 的量校正，将两者吸光度的相对量进行分析。重复3 次独立的半定量PCR全过程。

1．2．3 PAI-1活性检测 取对数生长期细胞按20/孔接种于六孔板上培养24小时后，换用无血清的DMEM饥饿化24小时，换用含10%DMEM培养，实验分为四组：对照组、PDGF刺激组(20ng ／mlPDGF)、蟾蜍灵干预组(PDGF刺激12 h后，加入0.08μM蟾蜍灵干预12小时)、蟾蜍灵组（0.08 μM），于实验结束点取细胞培养上清液，-80^°C保存。按照PAI-1活性检测试剂盒说明书上操作检测。

1．3 统计学方法

定量数据以均数±标准差（±s）表示，组间差异比较采用SPSS13．0 统计软件进行单因素方差分析（One-way ANOVA） 和q 检验， 方差不齐时采用Dunnett T3 检验，P ＜ 0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2．1　PDGF和0.08 uM蟾蜍灵系膜细胞PAI-1、u-PA、t-PA的mRNA的影响

经凝胶图像扫描系统进行基因表达水平半定量分析，以PAI-1、u-PA、t-PA/GAPDH比值作为PAI-1、u-PA、t-PA的相对表达量。PDGF刺激组与对照组比， PAI-1mRNA较明显升高（p<0.05），u-PA、t-PA mRNA表达明显减少（p>0.05），0.08 μM蟾蜍灵干预后，PAI-1mRNA的表达下降（p>0.05），u-PA、t-PA mRNA表达明显增加。0.08 μM蟾蜍灵对正常GMC的PAI-1、u-PA、t-PAmRNA的表达都无明显影响（p>0.05）。（图1、表1）

 4       3       2      1    

注：1：对照组 2：PDGF-BB组3:蟾蜍灵+PDGF-BB组4：蟾蜍灵组

图1 PAI-1、t-PA、u-PA RT-PCR电泳结果图

表1各组PAI-1、u-PA、t-PA  mRNA相对表达量  ^aP<0.05 vs 对照组，^bP<0.05 vs PDGF-BB组

2．2　PDGF和0.08 uM蟾蜍灵系膜细胞PAI-1活性的影响

PDGF刺激组与对照组比，PAI-1活性明显升高（p<0.05），0.08 μM蟾蜍灵干预后PAI-1活性的下降（p<0.05）。0.08 μM蟾蜍灵对正常GMC的PAI-1活性无明显影响（p>0.05）。（图3）

图3 PDGF-BB和蟾蜍灵对GMC细胞PAI-1活性的影响  ^*P<0.05 vs 对照组，^#P<0.05 vs PDGF-BB组

4.讨论

肾小球细胞外基质(ECM)合成与降解失衡是ECM聚集和肾小球硬化的重要环节。已有很多研究报道，ECM降解减少在肾小球硬化中起了至关重要的作用。因此，促进ECM降解对预防和治疗肾小球硬化具有重要的意义。

ECM降解蛋白主要分为三类：丝氨酸蛋白酶类、基质金属蛋白酶类和半胱氨酸蛋白酶类。丝氨酸蛋白酶类系统中起最主要降解ECM作用的是纤溶酶原/纤溶酶系统。组织型纤溶酶原激活物（t-PA）和尿激酶型u-PA能促使纤溶酶原转变成纤溶酶，后者可降解ECM，同时可以激活另一蛋白酶系统¾基质金属蛋白酶系统。而纤溶酶原激活物抑制剂PAI-1尤其PAI-1可特异性抑制t-PA、u-PA的活性，从而使ECM降解减少。很多ECM聚集增加的疾病如：IgA 肾病、局灶节断性肾小球硬化、新月体肾炎、狼疮性肾炎、糖尿病肾病等都伴有PAI-1的表达上调^[4-6]。因此，PAI-1、t-PA、u-PA三者的平衡对维持肾小球ECM系统的正常功能起了非常重要的作用。抑制PAI-1表达，促进t-PA、u-PA表达成为理论上预防和治疗肾纤维化的靶点之一。

TGF –β是参于肾脏纤维化最重要的细胞因子之一，不但可使肾脏ECM 产生增多，而且还可诱导PAI-1产生抑制ECM降解，促进肾脏纤维化，在肾脏纤维化的发病机制中发挥重要的作用^[7,8]。结缔组织生长因子（CTGF）也可作用肾间质成纤维细胞和肌成纤维细胞(MyOF)调节其ECM产生^{[ 9]}。因此，阻断肾小管上皮细胞合成CTGF不仅可有效抑制其自身产生PA I - 1,也可减少成纤维细胞和MyOF分泌PA I – 1，进而促进间质ECM降解,延缓肾小管间质纤维化的进展。PDGF在多种肾脏疾病中介导和调节肾脏损害和修复的病理过程，尤其是肾小球疾病，PDGF是否也有类似促肾脏纤维化作用呢？。Frank^[10]等研究发现, PDGF - B 在病肾肾小管上皮细胞的表达远高于正常肾脏,而在肾间质纤维化的肾小管上皮细胞中的表达又要明显高于未发生纤维化的病肾。姜晓宇^[11]等发现PDGF可以促进系膜细胞PAI-1的表达及其活性，进而导致肾小球硬化，这与我们的研究结果相一致。我们研究还发现PDGF还进一步抑制了t-PA、u-PA的转录，而蟾蜍灵可抑制PDGF诱导的PAI-1上调，而且使得t-PA、u-PA的转录增加，最终激活纤溶酶原/纤溶酶系统，缓解了PDGF的促纤维化作用。蟾蜍灵这种抑制系膜细胞异常高表达PA I - 1的能力,为其在病理状态下保护和改善系膜细胞功能发挥了积极作用,这也可能是蟾蜍灵防治肾脏纤维化作用机制之一。

参考文献

[1] Sun L, Chen T, Wang X, Chen Y, Wei X. Bufalin Induces Reactive Oxygen Species Dependent Bax Translocation and Apoptosis in ASTC-a-1 Cells[J]. Evid Based Complement Alternat Med,2009,

[2] Li D, Qu X, Hou K, et al. PI3K/Akt is involved in bufalin-induced apoptosis in gastric cancer cells[J]. Anticancer Drugs,2009,20(1):59-64

[3] 李善文,甘卫华,陈荣华,张爱青,潘晓勤,费莉. 蟾蜍灵对脂多糖诱导的大鼠肾小球系膜细胞凋亡的影响[J]. 南京医科大学学报(自然科学版),2009,(05):674-677+714

[4]   Deyoung MB, Tom C, Dichek DA. Plasminogen activator inhibitortype 1 increases neointima formation in balloon injured rat carotid arteries[J]. Circulation,2001,104(16):1972.

[5]   Yamamoto K, Loskutoff DJ, Sasto H. Renal exp ression of fibrinolytic genes and tissue factor in a murine model of renal disease as a function of age[J]. Semin Thromb Hemost, 1998,24: 261-268

[6]  Torii K, Kimura H, Li X, et al. Diabetic nephropathy and plasminogen activator inhibitor 1 in urine samp les[J]. Rinsho byori,2004,52(6):506 - 512

[7] 　Gore - Hyer E, Shegogue D,MarkiewiczM, et al. TGF - beta and CT2 GF have overlapp ing and distinct fibrogenic effects on human renal cells[J]. Am J Physiol Renal Physiol, 2002, 283: F707-F716

[8] 　Kutz SM, Hordines J,Mekeown-longo PJ, et al. TGF-β1 induced  PAI-1 gene exp ression requires MEK activity and cell-to-substrate adhesion[J]. J cell Sci, 2001,114: 3905 - 3924

[9] 　Wang S, Denichilo M, Brubaker C,et al. Connective tissue growth factor in tubulointerstotial injury of diabetic nephropathy[J]. Kidney Int, 2001,60:96-105

[10]　Frank J ,Engler - Blum G,et al. Human renal tubular cells as a cytokine source:PDGF-B,GM-CSF and IL-6 mRNA expression in vitro[J].Experimental Nephrology,1993,1(1):26-35

[11] 肖雨龙, 姜晓宇, 王浩. 肝细胞生长因子对培养大鼠系膜细胞低密度脂蛋白受体表达的影响. 第二军医大学学报, 2005,(11): 61-63