钟  瑜  浙江中医药大学 

 徐再春  浙江省立同德医院  

肾脏纤维化是各种原因导致慢性肾脏疾病发展到晚期终末期肾病(end stage renal disease, ESRD)的共同病理途径，其主要病理改变是实质细胞的减少、间质细胞和细胞外基质(extracellular matrix, ECM)的异常增多。肾功能的恶化趋势取决于肾小管间质损伤的范围和程度。肾小管间质病变程度是反映肾功能下降严重程度和判断预后最重要的指标。因此通过探索肾纤维化的细胞信号传导机制，从细胞水平摸索有效的防治措施，对延缓肾功能衰竭意义重大。

转化生长因子β(transforming growth factor beta, TGF-β)是一种多功能细胞因子，属于一个细胞因子超家族，包括TGF-β、活化素(activin)、抑制素(inhibin)、骨生成蛋白(bone morphogenetic proteins, BMP)和穆勒抑制物(Mullerian-inhibiting substance)等，有调节细胞分化、增殖与凋亡，调控细胞粘附以及ECM的合成等作用，与肾脏等组织器官纤维化关系密切。近年来，大量对肾纤维化分子机制的探讨以及各种试验均证实TGF-β1是介导细胞凋亡和肾纤维化发生最关键的细胞因子，其在肾损伤后会导致细胞凋亡，加速肾小管萎缩，肾间质纤维化，导致肾功能损害。

目前关于TGF-β1的下游信号转导途径研究比较热门的有3条：Smads信号转导途径、促有丝分裂素活化蛋白激酶(mitogenactivated proteinkinase, MAPK)途径、Rho/Rock途径。其中研究最为充分的是TGF-β1/Smads通路。现试述于下：

1. Smads信号转导途径

TGF-β可与跨膜受体结合而发挥生物学效应，与之结合的受体是具有丝氨酸／苏氨酸激酶活性的异二聚体，分别为Ⅰ型、Ⅱ型受体。TGF-β首先与Ⅱ型受体结合，引起Ⅰ型受体磷酸化而激活，进而催化其下游信号分子Smads磷酸化，引起一系列信号转导的级联反应。Smads蛋白家族是脊椎动物、昆虫和线虫体内发现的转录因子家族，是TGF-β家族信号转导通路中的胞浆递质。目前发现脊椎动物有8种不同的 Smad蛋白。按功能分为3类：受体调节性Smads (R-Smads，包括Smad1、2、3、5和8)、Co-Smads(Smad4)和I-Smads(包括Smad6、7)。R-Smads能被Ⅰ型受体激活，它又被分为2类：Smad1，Smad5和Smad8受BMP特异性激活，而Smad2和Smad3受TGF-β和激活素(activin)特异性激活。Smad4是TGF-β家族各类信号转导过程中共同需要的介质。Smad2 和 Smad3 通过Smad锚着蛋白 ( Smad anchor for receptor activation ,SARA)与细胞膜上的TGF-β受体结合，从而形成TβR-Ⅰ-SARA-Smad 复合体。R -Smads羧基端特征性丝氨酸基序( SSXS motif )可被Ⅰ型受体磷酸化而激活。活化的 R - Smads 与共同通路 Smads(common - pathway Smad ,Co - Smad)即 Smad4 形成异多聚体，随后这一复合物进入核中，调节靶基因的转录。R -Smad/ Smad4 复合物可直接与 DNA 上含 CAGA 序列的Smad结合元件(Smad - binding elements ,SBE)结合，SBE存在于许多受 TGF -β调节的基因的启动子区域。但是在大多数情况下，Smad通过转录因子与DNA结合，现已证明这些转录因子包括 AP - 1、 Fast - 1、 Fast - 2、 TFE3 和SP1。R - Smads 和 Smad4 还可以与转录复合活化物如P300/ CBP或复合抑制物如 TRIP - 1、 SnoN、 Ski 和 SNIP结合，以激活或抑制基因的转录。第三类 Smad 蛋白，即抑制性 Smads (inhibitory Smads ,Ⅰ- Smads)包括 Smad6 和 Smad7。Ⅰ- mads羧基端没有SSXS基序，所以不能被受体磷酸化，但可竞争性地与活化的Ⅰ型受体牢固结合，阻止 R - Smads 的磷酸化。此外，Smad6 还可抑制 Smad4 与 R - Smads的结合，从而抑制信号传导。Smad7 由 TGF -β诱导产生，对 TGF -β信号传导起自身负反馈调节的作用，Smad6由BMPs诱导产生，抑制TGF -β和BMP的信号传导。

2. MAPK信号转导途径

最近的研究显示，TGF-β1除了通过Smads途径进行信号转导外，还能通过其他通路进行信号转导。其中有丝分裂原活化蛋白激酶(Mitogen activated protein kinase, MAPK)级联是细胞重要的信号转导系统，为细胞内信息传递的共同通路，主要参与应激条件下细胞的凋亡、免疫调节、细胞转分化及炎症反应过程。

哺乳动物细胞MAPK通路包括细胞外信号调节激酶(extraeellular-signal-regulatedkinase, ERK)通路、p38MAPK通路、c-jun氨基末端激酶(c-jun amino-terminal kinase, JNK)通路和ERK5/BMK1(big MAPK1)通路四个亚族。现已发现MAPK通路参与TGF-β信号传导有2条[1]：c-Raf/MK1、2/ERK1、SEK1/MRK4、7/JNK和MEKK1/MKK3、6/p38。MAPKs是丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶,ERKs被丝裂原刺激活化,调节细胞的生长和分化；JNK s和 p38受体环境应激和炎症性细胞因子的刺激活化,在细胞凋亡和细胞因子表达中起重要作用。活化的MAPKs至细胞核磷酸化和活化转录因子,ERK的活化因子是转录因子ELK-1,而JNKs和p38的底物是c - Jun、 ATF-2和ELK-1。小G蛋白Ras和Rho蛋白Rac、cdc42是 MAPKs活化的重要调节因子,通过活化的GTP结合状态与非活化的 GDP结合状态之间的交接而起作用；生长因调控的Ras鸟苷酸交换因子活性使Ras与Raf 结合,通过MEK1活化ERK，Rac和cdc42控制JNK s和p38通路。

其中p38MAPK是哺乳动物MAPK信号通路中的一条经典途径，1993年由由browster等(2)在研究高渗环境对真菌的影响时发现。1994年Han等首先从小鼠肝脏cDNA文库筛选到编码p38MAPK的克隆，其编码由360个氨基酸残基组成的38kD蛋白(3)。新近资料表明p38MAPK存在6种异构形式，即p38α1/α2、p38β1/β2、p38γ、p38δ，β2、 p38 γ和 p38δ,其不同异构体的分布具有组织特异性。p38α在各种组织中广泛存在；p38β以脑组织含量最丰富；p38γ主要存在于骨骼肌中；p38δ则多见于睾丸、 胰腺、 前列腺、 小肠等处。

p38MAPK级联反应包括 4种激酶：PAK ( p21- activated kinase, MAPKKKK)、MLK (mixed lineage kinase, MAPKKK)、MKK3 /6 /4 (MAPKK)和 p38MAPK，它们构成了一个连续的蛋白激酶反应链。细胞外信号与受体特异结合后，通过磷酸化PAK和 MLK(主要为 MLK3) ，促进 MKK3 /MKK6基因表达，并使其表达蛋白磷酸化，进而诱导 p38MAPK基因转录，活化的p38MAPK通过上调活化转录因子 2 (ATF2)、 肌细胞增强因子2C (MEF2C)、 CHOP10 (C /EBP同源蛋白)等转录因子基因的表达和生物活性，影响细胞的增殖、分化和细胞因子的合成。p38MAPK通路可被多种物理和化学因素、炎性因子( T NF-α、IL- 1等 )、应激刺激 (脂多糖、缺血/再灌注、热休克等)及革兰氏阳性细菌细胞壁成分所激活。

P38MAPK在TGF-β1致肾脏纤维化中起重要作用。Wang L等研究显示，以TGF-β1刺激MKK3基因阳性小鼠(MKK3+/+)，发现肾小球系膜细胞P38MAPK被快速激活，而刺激MKK3基因阴性小鼠(MKK3-/-)则未见P38MAPK激活。说明P3MAPK可能是TGF-β1系统下游的一个通路，介导TGF-β1引致肾小球硬化，同时，TGF-β1激活P38MAPK必须有MKK3的存在(4)。Chin等报道，TGF-β1通过活化P38MAPK诱导鼠肾小球系膜细胞的前胶原I的合成，特异性阻断剂SB203580能抑制上述表达，说明P38MAPK在TGF-β1诱导的ECM合成中起重要作用。Stambe C等研究单侧输尿管梗阻(UUO)大鼠肾间质纤维化动物模型中P38MAPK信号通路的作用时显示：磷酸化P38MAPK在UUO大鼠肾间质成纤维细胞及肾小管上皮细胞均明显增加。而以特定P38a阻断剂NPC31169处理UUO大鼠，则肾间质纤维化程度明显减轻，同时TGF-β1mRNA和蛋白质水平与对照组相比却无明显变化。提示P38a可能作为TGF-β1系统下游信号分子在肾间质纤维化中起作用（5）。

3. Rho-Rock信号转导途径

Rho/Rho激酶信号通路在细胞的信号转导通路中作为信号转换器或分子开关是体内普遍存在的一条信号通路 ,不仅与许多血管活性因子 (如血清素、 凝血酶、 内皮素 - 1、 去甲肾上腺素、血小板衍生生长因子、细胞外核苷酸等)存在相互调控的关系(6),而且作用于细胞骨架或其靶蛋白后 ,诱发肌动蛋白细胞骨架重排、 调控基因转录及细胞周期等。

Rho蛋白是 Ras 蛋白超家族成员。1985年 ,Rho 作为Ras同源物首先被克隆出来 ,是一组分子量为 20～30 kD的GTP结合蛋白。在哺乳类动物细胞内有 RhoA、 RhoB、RhoC、 Rac1 和 Rac2、 Cdc42、 RhoG、 RhoD、 RhoE等20 余种不同 Rho 蛋白或称 Rho GTP酶(Rho GTPases) 。Rho GTPases是一类小 GTPases ,以无活性的结合 GDP 和有活性的结合GTP的方式发挥其重要的分子开关作用 ,其作用与细胞骨架的结构改变有关,同时与细胞形态、 极性、 细胞黏附、 转移、 信号传导、 细胞增殖、 凋亡及转型等多种生物学行为有密切关系。Rho 又有许多下游的效应分子 ,如 Rock (Rho相关卷曲螺旋形成蛋白激酶 ,Rho associated coiled coil forming protein kinase) 、 mDia、 Rhophillin、 Rhotekin、 citron 和蛋白激酶 N。

Rock属于丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶家族成员 ,是目前功能研究最为清楚的 Rho 下游靶效应分子。有ROC K1和 ROCK2两个亚型,分子质量约为 160 kD,两个亚型分布由两种不同的基因编码的。人的Rock2 1 和 Rock2 2 基因分别位于 18 号染色体( 18q11 . 1)和 2号染色体( 2p24)。肾脏组织中主要以 Rock - 1 形式存在。Rock 接受 Rho 传递的活化信号 ,发生多个氨基酸位点的磷酸化而激活 ,并介导下游一系列磷酸化/脱磷酸化反应 ,最终引起细胞肌动蛋白聚合状态改变 ,促进张力纤维形成和局部黏附激酶活化 ,从而影响细胞趋化、 黏附、 对钙离子的敏感性和细胞周期进展。ROCK又是一种低分子质量 G蛋白,属于 GTP结合蛋白类。低分子质量 GTP结合蛋白在多种细胞信号转导途径中具有开关作用。它们主要位于 MAPK系统的上游, 非活化状态时结合 GDP, 在外源信号下释放 GDP而结合 GTP, 使自身活化, 进而使其下游的 MAPK系统活化。ERK5和 ERK1 /2一样, 都有 Thr2 Glu2 Tyr (TEY)活化序列, 都能被生长因子激活且对细胞分化和增殖有重要作用。Rho在细胞骨架重构和 SMA启动子的活化过程中是不可缺少的，在TGF-β1诱导肾小管上皮细胞转变为肌成纤维细胞中起核心作用 。

综上所述，TGF -β在肾间质纤维化中 EMT 中的信号通路，主要是 TGF -β/ Smad 信号通路、 p38MAPK 和 Rho 途径。p38MAPK途径主要是诱导细胞的凋亡。当 TGF -β与细胞膜上的受体结合后 ,RⅡ 将 RⅠ 磷酸化后形成 RⅠ/ R Ⅱ复合物。活化的 RⅠ通过 RhoA 的效应分子 Rock ,增强细胞的迁移性和侵入性;同时活化的 RhoA和 Rock可通过 MLC诱导肾小管细胞α- SMA 的表达和肌动蛋白的重塑。

参考文献：

1. Joseph S. Cell signality by receptor tyrosine kinase [J].Cell, 2000, 103-211

2. Brewster J L, Valoir T, Dwyer N D, et al. An osmosensing signal transduction pathway in yeast [J].Science.1993, 259(5102):1760-1763

3. Han J, Lee J D, Bibbs I, et al. A MAP kinase targeted by endotoxin and hyperosmolarity in mammalian cells [J]. Science, 1994, 265(5173): 808-811

4.  stambe C，Atkins RC，Teseh GH.J Am Soc Nephrol，2004，15(2):370-379

5.  Wang L，Ma R，Flavell RA，et al. J Biol Chem，2002，277(49):47257-47262

6.　Funakoshi Y, I chiki T, Shimokawa H, et al. Rho-kinase mediated angiotensin Ⅱ-induced monocyte chemoattractantorotein-1 expression in rat vascular smooth muscle cells[J]. Hypertension, 2001, 38(1): 100-104