化瘀解毒中药对宫内感染致早产脑损伤仔鼠脑TNF-α和GFAP表达的影响

所属分类：医学论文日期：2018-09-04 浏览：次

河南中医学院第一附属医院儿科医院小儿脑病诊疗康复中心（450000）

党伟利马丙祥

摘要

目的观察化瘀解毒中药对宫内感染致早产脑损伤仔鼠脑组织中肿瘤坏死因子（TNF-α）和胶质纤维酸性蛋白GFAP表达影响，探讨化瘀解毒法改善宫内感染致早产脑损伤的机制，提出宫内感染所致脑瘫可以从毒、瘀论治。

方法（1）动物模型制备：12只孕第16天的脂多糖(LPS)组大鼠予LPS 450μg/kg·d，连续两天腹腔注射，8只生理盐水组孕鼠腹腔注射同剂量的生理盐水。孕22天前分娩的仔鼠为早产仔鼠。记录两组孕鼠的分娩时间及新生仔鼠的出生体重。仔鼠出生后即刻随机选LPS组和对照组孕鼠各2只取子宫和胎盘HE染色观察宫内感染情况，判断标准为大量中性粒细胞浸润。随机选LPS组和对照组仔鼠各8只断头取脑HE染色，观察脑室旁白质损伤情况。（2）随机选取生理盐水组足月产仔鼠8只作为空白对照组（A）和LPS组早产仔鼠24只。LPS组仔鼠随机分为3组，每组8只，分别为：血必净高剂量组（B），血必净低剂量组（C），模型组（D）。四组大鼠恒温恒湿，母乳喂养，7日龄时B组予血必净注射液8ml/㎏·d腹腔注射，C组4ml/㎏·d腹腔注射，A组与D组予生理盐水4ml/㎏·d腹腔注射，共14天。（3）21日龄时对四组大鼠进行神经行为学检测（采用悬吊试验），并取脑组织应用免疫组化方法对GFAP、TNF-α进行测定。

结果（1）血必净高、低剂量组可使宫内感染致早产脑损伤仔鼠在行为学方面得到改善(P＜0.05)。(2)化瘀解毒中药干预治疗后使宫内感染致早产脑损伤仔鼠脑组织中TNF-α表达减少而GFAP阳性表达增加(P＜0.05)。

结论（1）通过复制黑龙江佳木斯大学宫内感染动物模型，证实脂多糖（LPS）可以造成宫内感染引起仔鼠脑损伤，模型真实可靠。（2）化瘀解毒中药对宫内感染致早产脑损伤仔鼠脑组织中TNF-α和GFAP表达有调节作用，可明显改善宫内感染致早产脑损伤，其机制可能与降低脑组织中TNF-α和使GFAP表达升高有关。（3）毒、瘀是宫内感染所致脑瘫的主要病理因素，宫内感染所致脑瘫可从毒瘀论治。

关键词：宫内感染；脑白质损伤；脑性瘫痪；胶质纤维酸性蛋白；肿瘤坏死因子-α；

Abstract

Objective: To study the expression of GFAP and TNF-α during lipopolysaccharide- induced white matter damage in the early neonatal rat and the protection of xuebijing.

Method: Establishment of model:20 Wistar pregnant rats were randomly divided into two groups: LPS(n=12)and saline(n=8).Pregnant rats were consecutively injected with LPS(450μg/kg)or saline on gestation d 16 and 17.The pups whose gestation age was less than 22 days were preterm pups and were removed in both groups. We selected randomly saline neonatal rat group A(n=8)and LPS neonatal rat group B(n=8)、C(n=8) 、D(n=8).2、Early interfere: The 7 days rats(B、C)were therapy by injected with xuebijing(8ml/kg·d, 4ml/kg·d,) and the rats(A、D)were injected with saline (4ml/kg·d, 4ml/kg·d,). Neurobehavioral observation and appraising cerebral palsy: The Neurobehavior of rat was observed on 21d.The items of neurobehavioral observation included sensorimotor movement(hanging test and inclined plane test) voluntary movement, non-autokinetic movement.The data was analysed by the science of statistics.The cerebral palsy rats must have abnormal neurobehavior in aspects of sensorimotor movement and posture and muscle tension at the same time, accompanying or non-accompanying with the abnormity of non-autokinetic movement and emotional behavior,but the result of deflected plate test must be positive.4、Immunohistochemistry detection: The GFAP and TNF-α were detected in brain sections of 21 day rat.

Results: There was obvious increase about TNF-α expression in PWM in D group of 21 day rats, contrasted with the one in A group of 21 day rats(P<0.01);There was decrease about TNF-α expression in B and C group of 21 day rats, contrasted with D group of 21 day rats(P<0.05),it was no obvious decrease in B and C, (P>0.01); There was obvious increase about GFAP expression in PWM in B and C group of 21 day rats, contrasted with the one in A group of 21 day rats(P<0.01);There was decrease about GFAP expression in D group of 21 day rats, contrasted with B and C group of 21 day rats(P<0.05),it was no obvious increase in B and C, (P>0.01).

Conclusion:1. Chinese medicine of huayujiedu can adjust the expression of GFAP and TNF-α during lipopolysaccharide-induced white matter damage in the early Neonatal rat 2. Chinese medicine of huayujiedu can treat intrauterine infection-induced white matter damage in the early Neonatal rat ,the mechanism may be related to removal of TNF-α and increase in GFAP expression.3. We conclude that cerebral palsy induce by intrauterine infection could treated by the Methods of huayujiedu in the theory of Traditional Chinese Medicine .

Key Words：Intrauterine infection；White matter damage；cerebral palsy；GFAP；TNF-α；

小儿脑性瘫痪(Cerebral palsy，简称CP)，是自受孕开始至婴儿期非进行性脑损伤和发育缺陷所导致的综合征，主要表现为运动障碍及姿势异常^[1]。新生儿脑白质损伤(NWMD)被认为是脑瘫发生的最重要的危险因素，存在脑白质损伤者发生脑瘫的危险性将增加15倍^[2]，而宫内感染是导致早产脑白质损伤发生的重要原因，因此，预防宫内感染和改善其所致的脑损伤是防治脑瘫的重要方法，探讨有效改善脑损伤的药物具有重要的意义。

结合中医学理论，在脑性瘫痪长期临床诊疗基础上，提出了宫内感染病因导致的脑瘫可从毒瘀论治的理论观点。在此学术观点指导下，采用免疫组化方法，进行实验研究，以t检验统计分析结果。现将研究结果总结报道如下。

1 脑性瘫痪毒瘀病机的认识

宫内感染在中医病因学中属于“毒邪”，脑以精血为体，阳气为用，共同构成神明功能的物质基础，母孕之初感受毒邪，内舍胎儿，毒邪侵犯，导致气血津液运行不畅，阻于脉络，可形成瘀血；瘀血阻滞脑窍、累积蕴化日久则可内生为毒。毒瘀胶着，脑络损伤，脑髓破坏则神明失主、肢体失用、临床上可出现健忘失聪、反应迟钝、抽搐、语言蹇涩、斜视、肢体僵硬、屈伸不利、动作迟缓、活动不灵、运动障碍、舌质暗或有瘀点、指纹紫等证。

2化瘀解毒治法的提出

临床多数脑性瘫痪患儿有新生儿产伤史，颅内出血史及脑缺血缺氧病史，或母孕期宫内感染或胎盘异常，脐带异常等病因，以上因素均可导致瘀血内阻，气机不通，脑窍不开，经络阻滞，筋脉失养，继而导致运动障碍，肌肉挛缩，尖足及膝反张等脑性瘫痪的临床表现，研究表明脑性瘫痪患儿的血小板计数较正常健康儿童高^[3]，这也反映出脑瘫“瘀”的特点。我们在多年临床研究的基础上，依据祖国医学理论，提出宫内感染病因导致的脑瘫可从毒瘀论治。

3实验研究

一、材料与方法

1一般资料 1.1实验动物：清洁级成熟wista大鼠雌性20只和雄性大鼠10只，重量260g~350g，由河南郑州大学动物实验中心提供，合格证号0009792。1.2脂多糖溶液的配置：称取脂多糖10mg溶于100ml生理盐水中，浓度0.1mg/ml。1.3血必净注射液：由赤芍、丹参、当归、红花、川芎五味中药组成，每支10ml,每毫升含生药0.5g，单味中药浓度0.1g/ml，天津红日药业生产，批号：08081901。

1.4主要实验试剂、药品（本实验于河南中医学院第一附属医院儿科实验室进行）脂多糖（LPS血清型055:B5，美国Sigma公司）；兔抗人GFAP多克隆抗体工作液（美国ZYMED公司）；TNF-α 抗体（武汉博士德生物工程有限公司）。

2方法

2.1动物模型的制备^[⁴^]与分组

将雌性大鼠与雄性大鼠常规饲养，饮食自由，室温21℃左右。环境适应1周后，于下午17时以2:1合笼，次日上午8时查阴道脱落细胞涂片，以查得精子为孕第0天，孕鼠另笼饲养。

把受孕的大鼠随机分为LPS组（n=12只）和对照组(n=8只)。孕第l6天的LPS组孕鼠予LPS 450μg／㎏·d，连续2天腹腔注射，对照组孕鼠腹腔注射同剂量的生理盐水。记录两组大鼠的分娩时间及新生鼠出生体重。孕22天前分娩的仔鼠为早产鼠。仔鼠出生后即刻随机选LPS组和对照组孕鼠各2只取子宫和胎盘HE染色观察宫内感染情况，判断标准为大量中性粒细胞浸润。随机选LPS组和对照组仔鼠各8只断头取脑HE染色，观察脑室旁白质损伤情况。

2.2 模型病理学检测

1）切取子宫及胎盘放置于10﹪中性甲醛中固定。常规HE染色，光镜下观察宫内感染情况。

2）于生后0天，分别将两组大鼠于冰盒上断头取脑，剥离去除粗大血管，冷生理盐水冲洗数次，滤纸吸干，取一侧脑组织于耳间线前2mm水平行冠状切片，放置于10﹪中性甲醛中固定。常规HE染色，光镜下观察脑室旁白质损伤情况。

2.3药物干预

随机选取生理盐水组足月产仔鼠8只作为空白对照组（A）（n=8）和LPS组早产仔鼠24只。LPS组仔鼠随机分为3组，每组8只，分别为：血必净高剂量组（B）,血必净低剂量组（C），模型组（D）。四组大鼠恒温恒湿，母乳喂养，7日龄时B组予血必净注射液8ml/㎏·d腹腔注射,C组4ml/㎏·d腹腔注射，A组与D组予生理盐水4ml/㎏·d腹腔注射，共14天。21日龄时对四组大鼠进行神经行为学检测（采用悬吊试验），并取脑组织应用免疫组化方法对GFAP、TNF-α进行测定。

2.4 行为学检测

采用悬吊试验：使大鼠前腿抓住距离桌面45cm水平玻璃棒(直径0.5cm)，记录大鼠掉下的时间，并进行评分，两组比较。评分标准：1分：＜10s；2分：10s～30s；3分：30s～2min；4分：2min～5min；5分：＞5min。

2.5免疫组化法测定脑组织中GFAP、TNF-α

于生后21天，分别将四组大鼠于冰盒上断头取脑，剥离去除粗大血管，冷生理盐水冲洗数次，滤纸吸干，取一侧脑组织于耳间线前2mm水平行冠状切片，放置于10﹪中性甲醛中固定。组织常规脱水、透明、组织浸蜡后，石蜡切片机进行切片，切片厚度为4μm。经展片和烘片后可进行HE染色和免疫组化染色。

2.6免疫组化步骤：按免疫组化试剂盒说明进行。

2.7结果判断

胞浆内染色为棕黄色放射状突起GFAP阳性细胞；TNF-α阳性信号为胞浆呈棕黄色。

2.8定量方法

1）GFAP阳性细胞计数法^[⁵^]：选脑室旁白质部位，40×10倍视野下计数每0.1mm×1mm面积下阳性细胞数量，每张切片计数4个视野，取均值。

2）TNF-α蛋白：采用美国Image-Pro Plus软件对免疫组化染色图片进行光密度均值测定。

2.9统计方法

采用SPSS 13.0软件处理,计量资料以±S表示，二样本均数比较采用独立样本t检验，多组间均数比较采用单因素方差分析。

二、结果

1孕鼠分娩时间及仔鼠一般情况

表1 孕鼠活产仔鼠数及仔鼠出生体重比较

组别	孕鼠数量（只）	活产仔鼠数（只）	仔鼠出生体重
对照组（足月）	8	8.13±0.83	6.25±0.88
LPS组（早产）	8	5.63±0.74^**	4.75±0.70^**

注：与对照组相比 *P＜0.05 ** P＜0.01

结果表明：宫内感染后孕鼠大多出现早产，娩出活产仔鼠数目少，体重低，体质差。

2 HE染色结果

4.2.1孕鼠子宫及胎盘HE染色结果和新生仔鼠脑组织HE染色结果：

经子宫和胎盘HE染色后结果为大量中性粒细胞浸润，脑组织形态学改变为脑白质结构疏松，胶质细胞聚集，尚有脑室内出血，符合宫内感染致早产脑损伤病理学改变（见图3～4），且采用行为学测试结果模型组仔鼠反应迟钝、稳定性差，悬吊时肢体自主活动明显减少，下肢颤抖，很快掉落到桌上，与空白对照组比较差异有极显著意义。综合说明本实验宫内感染致早产脑损伤动物模型造模成功。

3 行为学测试结果

21日龄时对各组仔鼠进行行为学测试，结果如下。

表2 21日龄各组仔鼠行为学测试结果

组别	行为学检测得分
空白对照组	3.25±0.70^△△
高组	2.38±0.51^*^△
低组	2.25±0.46^*^△
模型组	1.63±0.51^**

注：与空白对照组相比*P＜0.05 **P＜0.01

与模型组相比△P＜0.05 △△P＜0.01

结果表明：模型组仔鼠反应迟钝、稳定性差，悬吊时肢体自主活动明显减少，下肢易颤抖，掉落到桌上；空白对照组大鼠反应快，动作灵活、准确，在玻璃棒上可自由运动，甚至可翻上玻璃棒并且沿玻璃棒爬行，与模型组比较差异有极显著意义(P＜0.01)；血必净高组和低组干预治疗后行为改善情况介于模型组与空白对照组之间(P＜0.05)，说明血必净高、低剂量组可使宫内感染致早产脑损伤仔鼠在行为学方面得到改善。血必净高、低剂量干预治疗的两组之间差异无显著意义（P＞0.05），说明血必净高、低剂量干预治疗改善仔鼠行为学方面作用相当。

4免疫组化结果

经免疫组化染色后，GFAP阳性细胞计数，选脑室旁白质部位，40×10倍视野下计数每0.1mm×1mm面积下阳性细胞数量，每张切片计数4个视野，取均值；TNF-α蛋白采用美国Image-Pro Plus软件对免疫组化染色图片进行光密度均值测定。经统计学处理后结果如下。

表3 大鼠脑组织TNF-α光密度均值和GFAP阳性细胞数比较

组别	TNF-α	GFAP（Periventricular white matter）
空白对照组	0.17±0.04^△△	3.25±1.39^△
高组	0.24±0.04^**^△	8.38±1.92^**^△△
低组	0.23±0.05^**^△	7.63±2.50^**^△
模型组	0.28±0.02^**	5.50±1.93^*

注：与空白对照组相比 *P＜0.05 **P＜0.01

与模型组相比 △P＜0.05 △△P＜0.01

TNF-α结果：①血必净高、低剂量组脑室旁白质中TNF-α含量近似，介于模型组和空白组之间（P＜0.05），说明血必净高、低剂量组可使对脑白质具有毒性的TNF-α含量下降，防止其对脑白质的进一步损害，提示干预治疗有效。②血必净高剂量组与低剂量组相比，脑室旁白质中TNF-α含量差异无显著意义（P＞0.05），说明血必净高、低剂量治疗宫内感染致早产仔鼠脑损伤的疗效无差异。（TNF-α各组数据经统计学处理后均数比较见图1，免疫组化染色见图5-8）

图1 TNF-α四组均数比较

GFAP结果表明：①血必净高剂量组、低剂量组脑室旁白质中GFAP阳性细胞数目相近且同属最高，与空白对照组相比P＜0.01，与模型组相比P＜0.05，说明血必净干预治疗可使具有保护和修复作用的GFAP阳性细胞数明显增高，改善宫内感染所致的早产脑损伤，干预治疗有效。模型组介于血必净高低剂量组和空白组之间（P＜0.05），说明宫内感染致早产仔鼠脑损伤后，脑室旁白质中GFAP表达反应增加。②血必净高剂量组脑室旁白质中GFAP阳性细胞均数高于低剂量组，说明血必净高剂量组疗效优于低剂量组，但经统计学处理差异无显著意义（P＞0.05），可能与样本量小有关。（GFAP各组数据经统计学处理后均数比较见图2，免疫组化染色见图9-12）

图2 GFAP四组均数比较

三、讨论

在对宫内感染导致新生大鼠脑白质损伤的研究中发现，宫内感染能使新生大鼠脑白质中胶质纤维酸性蛋白（GFAP）表达增加，证实了宫内感染和早产儿脑白质损伤的因果联系。GFAP是星形胶质细胞主要成分，可作为星形胶质细胞特异性标记物，其增加对脑损伤起保护和修复作用；肿瘤坏死因子（TNF-α）是宫内感染致发育中脑细胞炎性反应的重要介质，在WMD患儿脑星形胶质细胞和小胶质细胞中TNF-α表达均在较高水平。TNF-α可通过诱导其他炎性因子和细胞毒介质促进白细胞聚集、黏附因子表达、影响胶质细胞的表达参与中枢神经系统损伤，提示母体宫内感染后引起体内细胞因子的激活与释放，细胞因子网络反应可能是宫内感染后发生NWMD的主要机制。

血必净注射液有清热凉血、行气活血、解毒止痛之功效。现代药理研究血必净注射液有能有效拮抗内毒素，下调促炎介质水平并通过保护受损内皮、改善微循环，避免内毒素攻击所致的组织损伤等作用。本实验证实血必净注射液干预治疗后，宫内感染致早产脑损伤仔鼠脑TNF-α表达降低、GFAP表达增高，对脑损伤有保护作用。其可能机制为：降低宫内感染导致的炎症反应，阻断其激活发育中的星形细胞和小胶质细胞，从而抑制多种细胞因子产生，阻断和由血液中渗入的白细胞一起对这些细胞因子产生应答，进而减少脑白质组织中的星形细胞、OL及轴突等损伤。GFAP表达增高表明脑损伤后星形胶质细胞活化增生，血必净注射液可干预其活化状态，促进胶质化形成，在脑损伤修复中起到了一定的作用，可能是其治疗脑损伤重要机制之一。

由于宫内感染导致脑瘫过程中，毒、瘀互生互化，产生的病理产物成为重要的致病因素，造成脑组织及功能的进一步损害，导致智能下降乃至痴呆发生，不仅参与了脑神经元损伤链的病理过程，而且是难以好转的关键病因，治疗与用药方面应针对病因以化瘀解毒为法，及时清除及抑制这些有毒物质及瘀血，阻断毒瘀互化的恶性循环链，以提高疗效和改善预后。

参考文献

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