于世寰 张一梅 焦桂微 刘凤岐  孔灵菲

【摘要】  目的 研究胸交感神经阻滞(TEB)对实验性低氧性肺动脉高压（HPH）大鼠血液动力学、病理形态学的影响。方法 选择健康雄性Wistar大鼠32只，体重230±30g，随机分为正常对照组、模型组、罗哌卡因组、生理盐水组各8只。正常对照组在常氧常压下饲养3周，其余3组大鼠在自制常压低氧(10±0.5)%舱内饲养3周，制备成低氧性肺动脉高压模型.随后正常对照组和模型组继续常氧常压饲养4周，罗哌卡因组和生理盐水组给与硬膜外腔置管分别注入0.2% 罗哌卡因和0.9%生理盐水各50μL行胸段（胸1-5）交感神经阻滞术（TEB）4周。测定大鼠平均肺动脉压(mPAP)、右心室肥厚指数[RV/(LV+S)];观察HE染色的肺组织小动脉变化，利用图像分析技术测定大鼠肺小动脉管壁厚度指标[管壁厚度与血管外周径的百分比（WT%）和管壁面积与血管总面积的百分比（WA%）]。 结果 1.模型组大鼠mPAP、右心室肥厚指数、WA%、WT%明显高于正常对照组，肺组织切片HE染色显示肺小动脉管壁明显增厚，管腔明显狭窄。2.TEB 4周后罗哌卡因组mPAP明显降低、RV/(LV+S)比值减小、肺小动脉管壁厚度降低。结论 TEB能够降低HPH大鼠的mPAP，改善肺血管和右心室的重构。

【关键词】  低氧性肺动脉高压；胸交感神经阻滞；平均肺动脉压；右心室肥厚指数；

 Effect of thoracic epidural blockade on hypoxic pulmonary      hypertension in experimental rats

YU Shi-huan, ZHANG Yi-mei, JIAO Gui-wei, LIU Feng-qi,  Department of Pulmonary Disease,  First Hospital, Harbin Medical University, Heilongjiang 150001, China

Corresponding author: KONG Ling-fei .Pulmonary Disease Institute of China Medical University,Liaoning 110001, China

【Abstract】 Objective  Research the effect of thoracic epidural blockade(TEB) on haemodynamics，cardiac structure，structure of small pulmonary arteries  in hypoxic pulmonary hypertension (HPH) rats. Methods  32 healthy male Wistar rats，body weight 230±30g, were randomly divided into normal control group （8 rats）、 model group( 8 rats)、ropivacaine group（8 rats）and normal sodium group（8 rats）. Normal control group were rearing in normal pressure and normoxia for 3 weeks. Other groups were rearing in the normal pressure but hypoxic cabin oxygen concentration (10±0.5%) for 3 weeks. Then, normal control group and model group continued keeping in normal pressure and normoxia for 4 weeks. The rats of ropivacaine group and normal sodium group were intubated at cavitas epiduralis (thoracic 1-6) for TEB. Through this tube , 50μL 0.2% ropivacaine and 50μL 0.9% normal sodium were injected for a total of 4 weeks. Mean pulmonary arterial pressure(mPAP) and right ventricular hypertrophy index [RV/(LV+S)] in rats were determined ; using HE staining, by image analysis to measure the index of rat pulmonary artery wall thickness [Vascular wall thickness /Vascular periphery length (WT%) and vascular wall area /  total Vascular area(WA%)]; Results  1. The mPAP , RV/(LV+S) ,WA% and WT% in rats of model group were increasing strikingly after normal pressure and hypoxia for 3 weeks.2. Compared with model group and normal sodium group , the mPAP , RV/(LV+S) and pulmonary small artery wall thickness of the rats in ropivacaine group were decreasing strikingly after TEB 4 weeks. Conclusions TEB can reduce mPAP and improve pulmonary vascular and right ventricular remodeling

【Key Words】: HPH ;  TEB ;  mPAP ;  RV/(LV+S) ; 

肺动脉高压(PAH)导致的肺心病是继冠心病、高血压性心脏病之后第3位最为常见的心脏疾病^[1]。低氧性肺动脉高压(HPH)是慢性肺心病发生发展的关键因素，也是治疗肺心病的一个重要环节。肺血管结构重构是慢性HPH的主要难以逆转的重要因素，如何阻止及逆转肺血管重构是治疗慢性HPH的关键^[2]。既往治疗HPH的手段主要是血管扩张药，因对肺血管重构难以逆转,限制了血管扩张药在HPH的临床应用^[3]。目前认为缺氧可使交感神经过度激活，交感神经系统的慢性过度兴奋在血管重构和心力衰竭的发生、发展过程中起至关重要的作用，并且胸交感神经阻滞（TEB）在治疗扩张性心肌病和心力衰竭等心血管疾病中取得令人吃惊的效果^[4.5]。但胸交感神经阻滞（TEB）干预低氧性肺动脉高压(HPH)至今国内外仍未曾见报道，因此本实验欲利用TEB干预实验性低氧性肺动脉高压大鼠,观察大鼠血液动力学、右心室和肺小动脉管壁病理形态学的改变。

材料与方法

1.实验动物：健康雄性Wistar大鼠32只,体重（230±30）g ,中国医科大学动物学部提供。      

2.实验方法及步骤

2.1低氧性肺动高压大鼠模型的制备：选择健康雄性Wistar大鼠32只，实验时体重达到230g±30g，随机分为正常对照组、模型组、罗哌卡因组和生理盐水组各8只。正常对照组大鼠在常氧常压条件下饲养3周，其余各组大鼠放入自制常压低氧舱^[6]内饲养，舱内氧浓度稳定在（10±0.5）%，每天8:30～16:30低氧8小时，持续3周^[6]。

2.2 胸交感神经阻滞术：罗哌卡因组和生理盐水组给与硬膜外腔置管并留置，行胸段（胸1-5）交感神经阻滞（TEB）术^[7]，术后第二日通过硬膜外留置的阻滞管每天8:30～16:30分别注入0.2% 罗哌卡因50μL和0.9%生理盐水50μL,每4h注入一次，夜间停止给药，持续4周。正常对照组和模型组大鼠继续在常氧常压条件下常规饲养4周。在胸交感神经阻滞过程中罗哌卡因组一只大鼠因感染而死亡。

2.3平均肺动脉压（mPAP）的测定^[8]：胸交感神经阻滞术4周后各组大鼠以1%异戊巴比妥钠（10mg/kg）行腹腔麻醉后，背位固定在手术台，剪开颈前区皮肤，仔细分离右侧颈总静脉，结扎其远心端，在右侧颈总静脉近心端剪一V形切口，将一根充盈1%肝素的PE50聚乙烯导管自近心端插入，经右颈外静脉、上腔静脉、右心房、右心室进入肺动脉，导管的另一端经静脉压力换能器连接于GY-6328 Electrophysiology Lab Amplifier生物信号采集系统，根据生理多导仪示波器上压力波形判断导管的位置，待导管至肺动脉时，测定并记录各组大鼠mPAP。

 2.4右心室肥厚指数的测定及肺脏标本的制作：大鼠mPAP测定完毕后，立刻处死大鼠，开胸取出完整心脏和肺脏，用冰生理盐水漂洗心脏，剪去心脏的左、右心房组织及残余大血管，沿室间隔边缘剪下右心室，滤纸吸干后，分别称量各组大鼠右心室（RV）和左心室+室间隔（LV+S）的重量，计算右心室肥厚指数=右室/（左室+室间隔）[RV/(LV+S)]。肺脏用冰生理盐水漂洗，取右肺下叶组织放入有10%甲醛溶液中固定后，梯度乙醇脱水，取相同部位肺组织制成标本，石蜡包埋，垂直于支气管、细支气管断面，矢状位取材，沿肺门横断连续切片取材，切片用HE染色，显微镜下观察肺小动脉病理形态学变化。

2.5大鼠肺血管形态学分析： 将HE染色的肺组织切片在光镜下观察，并用Motic Med V6.0采集图像 ，Motic Images Advanced 3.0软件进行图像分析，测定与呼吸性支气管及肺泡管伴行的肺小动脉外周径、管壁厚度、血管总面积、管壁面积(血管总面积-管腔面积)，计算出管壁厚度与血管外周径的百分比（WT%）和管壁面积与血管总面积的百分比（WA%）；每个HE染色的肺组织切片中随机至少寻找并测量5条血管的上述指标，计算出均数。

2.6统计学分析：统计描述取中位数±平均差(M±A)，统计推断取Kruskal-Wallis法进行多个样本Rank-Sum tset，Nemenyi法进行两两比较Rank-Sum test。P<0.05为差异有统计学意义，

                                结果

各组大鼠mPAP 、RV/(LV+S)、WA%、WT%的变化 (见表1)

各组大鼠mPAP 、RV/(LV+S)、WA%、WT%的变化 (表1)

注: mPAP：平均肺动脉压；RV/(LV+S)：右心室肥厚指数；WA%：管壁面积与血管总面积的百分比；WT%：管壁厚度与血管外径的百分比

表1显示①H=2.70,ｖ=3, P<0.05, 四组大鼠mPAP差别有统计学意义。说明常压低氧3周后大鼠HPH形成，模型制备成功，大鼠经TEB 干预4周后，大鼠的HPH可以降低。②H=24.70, ｖ=3,  P<0.005, 四组大鼠右心室肥厚指数差别有统计学意义。说明实验性大鼠因慢性HPH导致了右心室壁增厚，经TEB 干预后，可逆转HPH的右心室肥厚。③H=22.75, ｖ=3, P<0.005, 四组WA %差别有统计学意义；H=23.42,ｖ=3, P<0.005, 四组WT %差别有统计学意义。说明常压低氧3周后实验性大鼠因慢性HPH导致了肺小动脉管壁增厚，经TEB 干预实验性HPH大鼠后，可逆转HPH的肺血管重建。

2.各组大鼠肺小动脉光镜观察的病理变化（图1-4）

    从图1-4看出，正常对照组大鼠肺小动脉管壁较薄，厚薄均匀，管壁层次结构清晰。模型组大鼠肺小动脉管壁明显增厚，管腔明显变小。罗哌卡因组肺小动脉管壁厚度变薄，肺小动脉管腔狭窄程度减轻。生理盐水组大鼠肺小动脉管壁仍增厚，管腔仍明显变小。

图1，HE染色 正常对照组x100倍         图2, HE染色 模型组x100倍

图3, HE染色 罗哌卡因组x100倍      图4，HE染色 生理盐水组x100

讨论

COPD和慢性肺源性心脏病在全球范围内发病率相当高，长期以来的研究表明，肺动脉高压的形成多数源于COPD所致的低氧因此HPH动物模型被广泛应用于该疾病发生的机制和治疗的研究。制备HPH动物模型的常用方法^[2]是常压低氧连续缺氧。HPH动物模型的复制成功与否有两个方面的判断指标：肺血流动力学和病理形态学改变。肺血流动力学改变表现为平均肺动脉压升高和右心室收缩压升高；病理形态学改变包括肺血管和右心室的改变^[6]。HPH引起的慢性肺心病是一种临床常见疾病,病死率相当高，至今尚无令人满意的治疗手段。既往治疗低氧性肺动脉高压的手段主要是应用血管扩张药，因种种副反应而限制了血管扩张药在慢性肺心病的临床应用。目前国外研究显示波生坦(Bosentan)、依前列环素（iloprost）等可用于治疗肺动脉高压药物，但主要是针对特发性肺动脉高压，而且价格昂贵无法在我国上市，有的正在欧洲等国家处于试验阶段^[9、10]。因此肺动脉高压的治疗仍是目前困扰临床医生的医学难题。

本研究结果显示模型组大鼠经低氧3周后，大鼠mPAP明显增高、右心室肥厚指数明显增大、WA%和 WT%也明显增大,说明实验性HPH大鼠模型制备成功，为进行胸交感神经阻滞来干预实验性HPH大鼠打下了坚定的基础。

胸段硬膜外阻滞是借助交感神经调节作用广泛的特性，有效地抑制神经内分泌的激活，并可能全面地抑制炎症反应。TEB对心脏的保护作用的研究已有多年，它能够逆转扩张型心肌病得心肌重构^[4、5]，我们推测它对于低氧性肺动脉高压的心肌重构和肺血管重构也可能有一定疗效。本实验欲利用TEB干预实验性HPH大鼠,观察大鼠血液动力学、右心室和肺小动脉管壁病理形态学的变化。

   本研究结果显示HPH模型大鼠进行TEB4周后罗哌卡因组mPAP降低明显，与正常对照组比较没有统计学意义, 与模型组和生理盐水组比较有统计学意义，说明TEB能够从肺血流动力学角度上降低HPH 的mPAP。肺动脉压力降低的原因可能是TEB阻滞了交感神经通路，去甲肾上腺素释放减少，致使血浆去甲肾上腺素的水平减低，交感神经张力降低，血管平滑肌舒张所致。另外TEB阻滞后还可能还逆转了因慢性低氧造成的肺血管壁肾上腺素能受体失衡状态，使β₂受体表达增多，α₁受体表达减少，这需要我们今后进一步实验来证实。

从病理形态学上，本实验从肺组织肺小动脉HE染色光镜观察看到，罗哌卡因组的肺小动脉管壁厚度变薄，肺小动脉管腔狭窄程度减轻；而生理盐水组肺小动脉管壁仍然增厚，肺小动脉管腔依然非常狭窄，与模型组比较没有明显改善。从肺血管形态学变化看，罗哌卡因组WA%、 WT%均减小，与模型理组比较均有统计学意义，与正常对照组比较无统计学意义；从右心室肥厚指数变化看，罗哌卡因组右心室肥厚程度减轻，与正常对照组比较无统计学意义，与模型组比较有统计学意义。这说明了实验性HPH大鼠经TEB 干预4周后，可部分逆转HPH引起的右心室肥厚和肺血管重构现象，其机制可能与胸交感神经阻滞使血浆细胞因子如肿瘤坏死因子-α降低有关，这也需要今后深入实验研究。

由于本研究病例采集较难，动物样本数量较少，胸交感神经阻滞（TEB）对肺动脉平均压、右心室和肺小动脉重构的影响以及机制本人在今后将进一步深入研究。但是本实验可以给我们一下提示，胸段交感神经阻滞术（TEB）将来在治疗低氧性肺动脉高压引起的慢性肺心病过程中可能具有一定的前景。

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10. Humbert M, Sitbon O, Simonneau G, et al. Treatment of pulmonary arterial hyhertension. N Engl J Med,2004，351(14):1425—1436．

项目基金：哈尔滨市攻关项目（2004AA9CS196-21）

作者单位：150001 哈尔滨医科大学附属第一医院 呼吸内科（于世寰 张一梅 焦桂微）； 心血管内科 刘凤岐 ：

          110001中国医科大学呼吸疾病研究所（孔灵菲）

通讯作者：孔灵菲 ，教授，博士生导师，