郝春秋 彭梅娟  谢玉梅 周云 魏欣 马力 王素娜 李瑞娟  张岩 白雪帆 贾战生*

第四军医大学唐都医院感染病诊疗中心，陕西  西安 710038

【摘要】目的  构建能介导CTGF基因RNA干扰的复制缺陷型腺病毒表达载体。方法 以大鼠CTGF基因为靶序列，设计并合成含编码短发夹RNA( shRNA) 序列的寡核苷酸, 构建腺病毒穿梭质粒p-shuttle-CTGF, 酶切及测序分析正确后，与腺病毒骨架质粒pAdEasy-1共转染AD-293细胞，进行病毒包装。用所得腺病毒载体Ad.H1-CTGF感染HSC-T6细胞，观察其对CTGF基因表达抑制的效果。结果　构建的腺病毒穿梭质粒p-shuttle-CTGF经酶切、测序分析证实正确。包装的病毒载体滴度为4×10¹⁰ PFU/ml，感染HSC-T6细胞后，Western blot 证实CTGF表达显著减少。结论　构建的腺病毒载体Ad.H1-CTGF可有效抑制HSC-T6中CTGF的表达，为抗纤维化研究提供了有力的工具。

【关键词】　结缔组织生长因子；　RNA干扰；　腺病毒载体

Construction and identification of replication-deficient adenovirus vector for RNA interference with CTGF gene.  

HAO Chun-qiu, PENG Mei-juan, XIE Yu-mei,ZhOU Yun, WEI Xin,WANG Su-na, LI Rui-juan, ZHANG Yan, BAI Xue-fan, JIA Zhan-sheng*  

Center of Infectious Diseases of Chinese PLA, Affiliated Tangdu Hospital, Fourth Military Medical University, Xi’an  710038, China

【Abstract】Objective:To construct a replication-deficient recombinant adenovirus vector that expresses small interference RNA (siRNA) against the CTGF gene. Methods: The siRNA sequence targeting CTGF mRNA was synthesized and shuttle plasmid p-shuttle-CTGF was constructed, which was co-transfected into AD-293 cells with the bone plasmid pAdEasy-1 to obtain the homologous recombination adenovirus vector Ad.H1-CTGF. The concentration of CTGF protein in HSC-T6 cells infected with adenovirus vector Ad.H1-CTGF was determined by Wetsern blot.Results: The p-shuttle-CTGF was identified by endonuclease and sequencing. The adenovirus vector Ad.H1-CTGF was successfully constructed with the titre of 4×10¹⁰ PFU/ml by purification. The concentration of CTGF protein in HSC-T6 cells was decreased observably after Ad.H1-CTGF infected by Western blot. Conclusion: The constructed Ad.H1-CTGF can effectively inhit the expression of CTGF in HSC-T6 cells,which provided a powerful tool for anti-fibrosis study.

Keywords  CTGF(connective tissue growth factor); RNA interference; 

          adenovirus  vector;

腺病毒具有宿主范围广、感染率高、包装容量大、繁殖滴度高、安全性好、性质稳定、载体制备较容易等特点^[1], 已成为应用最广泛的载体系统之一。结缔组织生长因子（CTGF）是重要的促组织纤维化蛋白，与肝、肺、肾等许多器官的纤维化密切相关^[2]，特别是促进胶原沉积致肝纤维化的主要细胞因子。RNA干扰（RNAi）可以在转录后水平阻断基因表达，使靶基因沉默，是研究特定基因功能的可靠技术^[3]。本课题试图利用RNA干扰原理，构建能介导CTGF基因沉默的复制缺陷型腺病毒载体，为肝纤维化的防治提供一个有用的工具。

[基金项目]：国家自然科学基金项目（30571658）

[作者简介]：郝春秋（1965-），男，博士，副主任医师，副教授

[通讯作者]：贾战生，（E-mail）haochq@fmmu.edu.cn

1  材料和方法

1.1材料

1.1.1 质粒、菌株及细胞：腺病毒载体系统（穿梭质粒pShuttle-H1、骨架质粒pAdEasy-1及包装细胞AD-293）由德国学者Reske SN 教授惠赠；大鼠肝星状细胞系HSC-T6购自ATCC；大肠杆菌BJ-5183和DH5a由本实验室保存。

1.1.2 主要试剂及工具酶： Hind Ⅲ、BglⅡ、T₄DNA连接酶、Taq DNA聚合酶、dNTP、PCR产物回收试剂盒及Plasmid Purification Kit 均为Promega 公司产品; 脂质体Lipofectamine 2000、 DMEM、RPMI 1640及胎牛血清均为Gibco公司产品; 抗CTGF单克隆抗体、抗β-actin抗体购自Abcam公司；山羊抗鼠IgG-HRP抗体购自Santa Cruz公司。

1.2  方法

1.2.1 靶向CTGF短发夹RNA的设计：根据小干扰RNA（siRNA）设计原则^[4-5],，参考GenBank公布的大鼠CTGF（NM-022266）核苷酸序列，利用Ambion公司在http:// www.ambion.com）设计工具，设计4对针对CTGF基因的siRNA序列（TS1-TS4）和1对无关阴性对照序列（TS5），并进行BLAST 同源性分析，保证序列的唯一性。为方便克隆与鉴定，在其5’端和3’端分别引入BglⅡ和Hind Ⅲ酶切位点，反义片段以后接终止信号TTTTTT以终止转录。形成BglⅡ酶切位点+19nt正义靶序列+9nt loop接头序列+19nt反义靶序列+终止信号+Hind Ⅲ酶切位点的结构（寡核苷酸由上海吉凯基因技术有限公司合成）。序列信息如下：

表1 编码siRNA的DNA双链体

1.2.2 腺病毒穿梭质粒p-shuttle-CTGF的构建及鉴定：将合成的单链寡核苷酸退火形成双链DNA并检测无误。用BglⅡ和HindⅢ双酶切穿梭质粒pShuttle-H1（图1）, 酶切产物纯化后, 用T4噬菌体DNA连接酶16℃连接线性化的pShuttle-H1及退火后的双链DNA 12h , 转化DH5A感受态细菌, 在含有卡那霉素抗性的LB平板上37℃培养过夜, 筛选扩增转化的阳性菌落, 提取质粒并纯化后获得腺病毒穿梭质粒p-shuttle-CTGF，应用EcoR I 酶切鉴定, 并将酶切后获得的小片段回收进行测序分析。

                图1：腺病毒穿梭质粒p-shuttle-H1图谱及构建示意图

1.2.3 复制缺陷型腺病毒载体Ad.H1-CTGF的包装和滴定：培养腺病毒包装细胞AD-293, 达80%～90%汇合时, 加入鉴定无误的腺病毒穿梭质粒p-shuttle-CTGF 1ug与骨架质粒pAdEasy-1 4ug, 用Lipofectamine2000脂质体转染,使之进行同源重组,第2天传代。转染7～10d后，75%～80%细胞出现CPE时收集细胞,-80℃和37℃反复冻融3次释毒, 离心冻融液收集上清,即为第一代腺病毒载体Ad.H1-CTGF毒种，作为随后大量病毒扩增的原液，3次扩增后获得病毒保存液。同法获得无关阴性对照病毒Ad.H1-Con原液及保存液，均-80℃保存。病毒的滴定采用TCID50法，即将病毒原液按10^-6～10^-127个浓度梯度稀释，分别接种生长于96孔培养皿的AD-293细胞,37℃培养72h,用X-gal染色，计算病毒滴度。

1.2.4 空斑实验检测腺病毒载体的感染性：将肝星状细胞系HSC-T6细胞低密度铺于6孔板中，培养1d后达60%～70%融合，用MOI（multiple of infection）为100的腺病毒载体Ad.H1-CTGF和阴性对照病毒Ad.H1-Con感染细胞，未感染病毒的细胞为对照，加甲基纤维素覆盖液后37℃培养7d，吸除覆盖液加结晶紫染色、清洗后观察空斑形成情况。

1.2.5 Western Blot检测病毒载体CTGF基因沉默效果：HSC-T6细胞于6孔板中培养1d达60%～70%融合后，用MOI为100的腺病毒载体Ad.H1-CTGF1～4和阴性对照病毒Ad.H1-Con感染细胞，37℃培养48h后裂解细胞、提取蛋白，进行SDS-PAGE凝胶电泳, 然后将蛋白条带电转移到硝酸纤维素膜上，以抗CTGF单克隆抗体为一抗（1：10）、山羊抗鼠IgG-HRP抗体为二抗（1：100）进行Western Blot，检测腺病毒载体对CTGF基因的沉默效果。 

2 结果

2.1 含靶序列的单链寡核苷酸退火产物检测：

    将合成的4对含靶序列、1对阴性对照序列的单链寡核苷酸90℃温育4min、70℃温育10min，缓慢冷却至室温进行退火，用12%非变性PAGE检测退火形成双链DNA的效率，均达90%以上（图2），提示退火产物合格，可以用来构建腺病毒穿梭质粒。

泳道：1：单链对照（单链，发卡结构）；2：双链对照【从上到下：双链(>90%)，

线性单链(<5%)，发卡结构单链(<5%)】；3-6：TS1-TS4；7： TSNC（阴性对照）

图2 退火产物电泳图

2.2  腺病毒穿梭质粒p-shuttle-CTGF的鉴定：

由腺病毒穿梭质粒p-shuttle-H1图谱(图1)可看出，MCS中含有2个EcoR I 酶切位点，EcoR I酶切后形成两个片段，大片段6600bp，小片段为300bp的H1启动子序列。如在BglⅡ和HindⅢ位点之间成功插入合成的寡核苷酸靶序列后，小片段长度则变为为360bp。电泳结果（图3）显示，阴性对照质粒p-shuttle-H1酶切小片段为300bp, 阳性克隆质粒p-shuttle-CTGF酶切小片段为360bp，大片段均为6600bp，初步证明重组腺病毒穿梭质粒构建正确。回收360bp小片段进行测序分析，证实序列完全正确（基因序列略）。

     1 Marker(DL-2000);  2 空载体p-shuttle-H1； 3-5 重组腺病毒穿梭质粒质粒p-shuttle-CTGF;

图 3  重组腺病毒穿梭质粒p-shuttle-CTGF的酶切鉴定

2.3 腺病毒载体的滴定和感染性鉴定：

采用TCID50法对病毒进行滴定，测出病毒保存液滴度为4×10¹⁰ PFU/ml。用MOI为100的目标病毒Ad.H1-CTGF和阴性对照病毒Ad.H1-Con感染HSC-T6细胞，未感染病毒的HSC-T6细胞为对照。病毒感染细胞7d后，目标病毒Ad.H1-CTGF组（A）和阴性对照病毒组Ad.H1-Con（B）均有大量空斑形成，未感染病毒的HSC-T6细胞未见空斑形成（C），说明构建的目标病毒和阴性无关对照病毒均具有较好的感染性。

A：目标病毒Ad.H1-CTGF；B：阴性对照病毒Ad.H1-Con；C: 未感染病毒

图4：包装的腺病毒感染的滴定

2.4  腺病毒载对CTGF基因沉默的Western Blot鉴定：

Western免疫印迹法检测发现，内参照蛋白β-actin的表达水平在6组之间无明显差异；而CTGF蛋白表达在包装的4组目标病毒感染HSC-T6细胞后均有不同程度降低，其中含靶序列TS3的病毒感染组降低最显著；无关序列阴性对照病毒感染组CTGF蛋白表达与未感染细胞组一样未见降低（图5）。提示构建的含TS3靶序列的腺病毒载体具有较好的CTGF基因沉默效果，命名为Ad.H1-CTGF，可作为以后抗纤维化研究的工具。

1：未感染组； 2: TS1组； 3：TS2组；4：TS3组；5：TS4组；6：TS5(无关序列)组

              图5: 各组病毒对CTGF蛋白表达的影响

3  讨论

我国是肝病大国，随着慢性肝病病程的延续，其纤维化的进程也一直持续，由于目前缺乏行之有效的根治办法，这些人都面临着肝硬化的潜在威胁，这已成了严峻的社会问题。因此，寻找有效的抗纤维化方法，阻止慢性肝病患者的肝硬化趋势，已成为我国乃至全球亟待解决的问题。

肝纤维化的成因，普遍认为与肝星状细胞（HSC）的活化有关^[6]， TGF-β是目前公认的致纤维化最强的细胞因子之一，其促纤维化作用主要是通过诱导其下游因子CTGF的表达，活化HSC来完成。业已证明，CTGF与肝、肺、肾等器官的纤维化，皮肤瘢痕形成，创伤修复及动脉粥样硬化密切相关^[7]。由于CTGF的生物学效应相对单一，主要介导TGF-β的促细胞增殖和ECM合成等作用。因此，阻断CTGF表达或抑制其活性，可能是一种更特异、更有效地防止肝纤维化的手段。

RNAi技术具有高效性和高特异性，作为关闭基因的新技术，已被广泛应用 ^[8]。   RNAi的产生需要向细胞内导入siRNA或者在细胞内表达siRNA，前者是将体外合成的siRNA直接导入细胞内，虽简单，但导入的siRNA易降解，且以瞬时表达为主,目前已较少使用；后者通过表达siRNA的质粒或病毒载体在靶细胞内转录siRNA，发挥RNAi作用，因方便、稳定和高效，成为主流方法。腺病毒载体可以直接、高效、稳定地感染细胞，避免了质粒转染效率低而带来的不便，逐渐成为该领域的研究热点^[9-13]。

本文根据siRNA设计原则^[4-5]，设计4对针对CTGF基因的siRNA序列（TS1-TS4）和1对无关阴性对照序列（TS5），退火形成双链DNA并检测无误后定向克隆至pShuttle-H1的H1启动子下游，获得腺病毒穿梭质粒p-shuttle-CTGF1-5，酶切、测序鉴定无误后与骨架质粒pAdEasy-1共转染AD-293细胞,同源重组后获得4株腺病毒载体Ad.H1-CTGF1-4和1株阴性对照病毒Ad.H1-Con，空斑实验证实它们均具有较好的感染性，Western Blot检测发现，4组目标病毒对HSC-T6细胞CTGF蛋白表达均有不同程度的抑制，其中Ad.H1-CTGF3的抑制效果最好，抑制率达85%，达到了设计要求。该腺病毒载体的构建成功，将为抗纤维化的研究提供可行的工具，为肝纤维化和肝硬化的防治奠定基础。

参考文献

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