中国医科大学附属第一医院神经外科 李中岩¹ 吴安华² 王运杰³

通讯作者：中国医科大学附属第一医院 博导 王运杰

【摘要】目的：研究肿瘤细胞裂解物对于肿瘤自身的生物学行为存在什么影响。方法：Mtt，Transwell，分析增殖，侵袭情况。结论：肿瘤细胞裂解物对肿瘤自身存在着促进肿瘤细胞增殖，促进侵袭能力。

【关键词】：肿瘤细胞裂解物     MTT     transwell   

背景：神经胶质瘤简称胶质瘤，是发生于神经外胚层的肿瘤。各型胶质瘤中，以星形细胞瘤最多，其次为胶质母细胞瘤，其后依次为髓母细胞瘤、室管膜瘤、少枝胶质瘤、松果体瘤、混合性胶质瘤、脉络丛乳头状瘤、未分类胶质瘤及神经元性肿瘤。各型胶质瘤的好发部位不同，如星形细胞瘤成人多见于大脑半球，儿童则多发在小脑；胶质母细胞瘤几乎均发生于大脑半球；髓母细胞瘤发生于小脑蚓部；室管膜瘤多见于第4脑室；少枝胶质瘤大多发生于在脑半球。神经胶质瘤在颅内各种肿瘤中最为多见。在神经胶质瘤中以星形细胞瘤为最常见，其次为多形性胶质母细胞瘤，室管膜瘤占第三位。胶质细胞瘤的生长特点为浸润性生长，与正常脑组织无明显界限，多数不限于一个脑叶，向脑组织外呈指状深入破坏脑组织，故无法从细胞学上全部切除肿瘤。放疗的疗效效果不一，化疗的疗效也尚不肯定，且存在着手术之后的胶质瘤复发存在着级别增高的趋势，这就是一个世界性的难题，本文就是对这一现象的探讨。

材料和方法：

1．肿瘤细胞裂解物的制备：取对数生长期的肿瘤细胞，细胞浓度约1*10⁶时胰酶消化细胞，反复吹打制悬离心后去上清，直接置入-70度冰箱，隔夜后取出迅速移入室温融化。这个过程反复重复3次即可。每3*10⁶个细胞反复冻融约能提取100微升裂解物，而预实验中得出每100个肿瘤细胞冻融裂解物干预1个肿瘤细胞促进增殖明显。

2．肿瘤细胞系为购买的上海肿瘤细胞研究所的高代数肿瘤细胞。细胞超净台，细胞培养箱，台式高速离心机，4℃冰箱，-20℃低温冰箱，-70℃超低温冰箱，显微镜，流式细胞仪，相差倒置显微镜，雪花状制冰机等由中国医大中心实验室提供。细胞培养板，玻璃烧杯，玻璃棒，离心管架，离心管，酒精灯，75%酒精和，95%酒精，6孔板，transwell板，24孔板，96孔板。gibcoDMEM高糖型培养基，四季青胎牛血清（FBS）, PBS缓冲液、胰蛋白酶、0.02%EDTA，青霉素，链霉素，MTT，Matrivgel基质胶。

第一部分  MTT法测肿瘤细胞裂解物对肿瘤细胞自身的作用

一．步骤：

1铺板：用含10%胎牛血清培养的对数生长期的U87和U251，消化吹打制悬的单细胞悬液，计数，调整细胞浓度为1.5*10⁴个，接种到96孔板中，每孔200ul。即每孔铺3000个细胞。共铺五个板，观察时间分别设为0天，1天，2天，3天，4天.

2.干预细胞：干预肿瘤细胞设4个浓度梯度，每行加入干预液10微升。但干预液浓度为四个浓度梯度，即从最高干预浓度从每行加入干预液10微升，干预液中肿瘤细胞裂解物实质上是从10微升（B组），到1微升（C组），0.1微升（D组），0.01微升（E组），逐级10倍稀释的，设最后一行对照组（F组），加入正常含血清培养基10微升。

3.加入MTT液，每孔加入MTT液20微升，与细胞共培养4小时后吸出共培养液加入150微升DMSO，摇床震荡１０分钟，使结晶物充分溶解。

４.比色。选择490nm波长，在酶联免疫监测仪上测定各孔光吸收值，记录结果，以时间为横坐标，OD值为纵坐标绘制细胞生长曲线。

二．结果

统计结果:应用spss16.0对组间的OD值进行独立样本t检验，分析结果如下

注：b组为最高浓度干预组，c组干预液浓度稀释10倍，依次类推，f组为对照组。

结果：从分析结果得知，经过干预后的肿瘤细胞在第二天和第三天增殖明显，组间差异显著。干预浓度越高，增殖效果越明显。第一天组间差异不明显可能是刚开始干预，肿瘤细胞正处于对数生长的前期，尚未分裂，这也符合u87和u251两三天一代的特点。第四天U87组间差异不明显是因为细胞长满了96孔板，出现了生长抑制，显微镜镜下得到证实。而u251从形态上要比u87要小和增殖程度都没有u87快的角度来看，第四天U251组间差异明显也很好解释。对于组间的差异，e和f组之间没有明显差异可以解释为E组干预浓度和B组相比已经稀释了1000倍，干预效果不明显。

第二部分：transwell法测肿瘤细胞裂解物对肿瘤细胞自身的作用。

一．步骤：

1.首先在6孔板中培养细胞，u87调整浓度为1*10⁵个，Matrivgel需在冰上维持液态，室温时可迅速凝结成胶。所以使用前应从-20℃转移至4℃过夜放置待其自然溶化。使用时需接触离心管、移液吸头等均应预冷于4℃。Matrigel使用前需进行1：7与无血清培养基稀释。

干预细胞：取用计数板计数后的1*10⁵个细胞悬液加入6孔板中1毫升，加入干预液350微升。共培养1天，两天，三天，四天后加入transwell上室中。

2．铺板细胞：取干预后的对数生长期的细胞消化吹打制悬细胞悬液离心去上清，加入0.1%血清培养基，u87调整细胞浓度为5*10⁴个，u251调整细胞浓度为1.5*10⁵ 个（由于预实验中发现u251的侵袭能力不如U87，细胞浓度5*104个透过Matrivgel的细胞很少，所以浓度调大来获得更好的计数），稀释后的Martrigel胶铺在transwell24孔板上下室之间经过一夜烘干后，上室每孔加入200微升含0.1%培养基的细胞悬液（铺有Martrigel面朝向上室），在下室中加有20%血清培养基500微升，即transwell板的杯子中U87每孔铺一万个，而u251每孔铺三万个 。24小时后用干棉签蘸走杯中上层未穿透Martrigel的细胞，提出杯子浸泡在甲醇和冰乙酸1：3比例的固定液中进行固定，半小时后gimsa染色，染色10-20分钟，小心用小流自来水冲洗杯子侧壁，烘干，显微镜下观察细胞形态如图。图表一为U87细胞，图表二为U251细胞，均为20倍镜下观察。

图表 1

图表 2

统计结果如下

二．结果：

由此可见，u87的侵袭能力在第二天和第三天达到顶峰，这与MTT第二天和第三天增殖明显的结果颇为类似，而且干预组与对照组差别明显，2，3，4天T值均<0.05。

U251的侵袭能力与u87相比逊色很多，但干预后的肿瘤细胞仍然在2，3，4天的侵袭能力与对照组相比强的还是很明显。

讨论：

神经系统肿瘤在国内外报道较多，且数量也日趋增大，各家统计的发生率也有较大差异。今年来随着诊断技术的不断完善及人口素质的提高，中枢神经系统肿瘤的发病率呈上升趋势。脑胶质瘤是最常见的颅内原发性肿瘤,占颅内肿瘤的41%~44. 6% ,发病高峰分别在30~40岁和10~20岁，胶质瘤大多数呈膨胀性和浸润性生长,预后相对较差。Deorah等【1】报道,在所有胶质细胞瘤中占半数的胶质母细胞瘤患者1年生存率约为30%, 5年生存率不足5%。

但胶质瘤的病因至今未完全明确，目前较为大家接受的是由正常组织或胚胎残留组织受到遗传的，生物的，化学的或物理的刺激因素，引起间变，一方面无限制的增殖，另一方面细胞程序性死亡的减少，从而导致肿瘤细胞的发展。近年来分子生物学的研究表明，导致细胞间变的分子基础是原癌基因的过量表达及抑癌基因的突变和丢失。这种癌基因的诱导表达或抑癌基因的突变和丢失均为逐渐发展造成的。在病毒，射线，化学致癌物等各种因素刺激下，出现细胞基因的改变，细胞失去正常增殖规律而癌变。

肿瘤细胞裂解物是这几年的研究热点，其研究主要方向是肿瘤细胞裂解物致敏的树突状细胞提呈肿瘤抑制性抗原的研究。肿瘤细胞裂解物致敏【2】的DC可递呈已知或未知的肿瘤相关抗原，且它能增加触发特异性T细胞克隆靶点，可能递呈单个或多个抗原而导致免疫逃逸。光动力学处理的肿瘤细胞裂解物【3】体外可促进DC成熟使其表面高表达共刺激分子CD80，CD86和MHC-2.而负载自体肿瘤细胞裂解物【4】的ＤＣ疫苗联合ＣＩＫ细胞治疗能提高晚期肾癌患者特异和非特异细胞免疫功能。机制可能是ＤＣ负载肿瘤细胞裂解物高表达MHC-1 MHC-2类抗原细胞提成和CD80，CD86共刺激分子，刺激患者体内初始或静息状态的T细胞被大量激活，增强T淋巴细胞对特异靶细胞识别和杀伤作用。其提高晚期肾癌患者非特异性免疫功能机制。一方面可能是由于抗肿瘤活性CIK细胞输入，另一方面可能是由于DC分泌多种细胞因子如IL-2，IL-12，促进患者体内NK细胞活化。Hoffman【5】认为凋亡细胞必肿瘤细胞裂解物更有效的产生自体CD8CTL。一方面凋亡细胞科提供抗原信号诱导特异性免疫反应。另一方面DC吞噬坏死或凋亡细胞后出现成熟反应，上调趋化因子，细胞因子及共刺激因子。另外albert认为【6】DC与凋亡细胞共培养可产生肿瘤特异性CTL，而坏死细胞不可以。肿瘤细胞裂解物【7】作为肿瘤抗原来源用于树突状细胞冲击有很多潜在的优势。首先，提供体内生理条件的加工过程。裂解物是多价抗原，可能含有未被发现的重要肿瘤表位。多价抗原负载于DC有可能诱导CTL多克隆放大，提高抗肿瘤作用，用此法抗原易获取和制备，有广泛的临床应用潜力。肿瘤细胞裂解物部分的能够促进树突细胞和巨噬细胞的活化，且能够产生保护性的体液免疫【8】【9】【10】，和DC表达的IL-12为临床免疫治疗提供途径【11】。。

脑胶质瘤目前的标准治疗法依旧【12】【13】是手术之后辅助放化疗。且在胶质母细胞瘤上治疗依然不尽人意，复发往往出现在原位置附近【14】【15】【16】。更大的挑战体现在胶质母细胞瘤对放化疗的抵抗，效果不好【17】。肿瘤的免疫逃逸，缺少树突状细胞的抗原提成是造成机体对肿瘤的免疫忽视，也是胶质细胞瘤难治的原因所在. 【18】【19】【20】

以上研究倾向于肿瘤细胞裂解物对抗肿瘤方面的研究，而本研究实验却发现纯粹的肿瘤细胞裂解物能够对肿瘤细胞起到促进增殖及侵袭能力，细胞周期未做进一步研究是本实验的遗憾所在。这也就能部分的解释了肿瘤细胞的复发后肿瘤细胞的级别会增加，和如果肿瘤中心出现的坏死的肿瘤，其级别也往往较高。更好的研究肿瘤复发的原因，才能更好的为肿瘤治疗提供最有效的帮助，方能为肿瘤患者提供最有效的治疗。

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