陈锦章 谢剑明 李爱民 郑大勇 郑航 罗荣城

【摘要】 目的：研究胃癌组织中HPSE、VEGF蛋白的表达与临床病理特征及生存期的关系，探讨其作为胃癌预后指标的可行性。方法：应用免疫组织化学方法检测具有随访资料的103例胃腺癌标本中HPSE、VEGF蛋白的表达，并将检测结果与临床病理特征进行综合分析。结果：①103例胃癌组织中HPSE、VEGF蛋白的阳性表达率分别为57.3％（59/103）、46.6％（48/103），在胃正常组织中均无表达；②HPSE、VEGF蛋白表达与患者的性别、年龄、肿瘤大小、部位、分化程度均无相关性（P>0.05），而与肿瘤的浸润深度、病理分期、淋巴结转移、远处转移相关（P<0.05 ）；③HPSE、VEGF蛋白表达阳性患者中位生存时间分别为11.0个月、12.0个月，表达阴性患者中位生存时间分别为70.0个月和60.0个月，表达阳性与阴性患者间生存时间有显著性差异（P<0.05）；④胃癌中HPSE蛋白表达与VEGF蛋白表达呈正相关，相关系数r=0.675（P＜0.05）。结论：HPSE、VEGF的表达可作为临床判定胃癌恶性程度及评估预后的指标，对指导靶向治疗和预测预后具有一定的意义。

　Relationship Between the Expression of HPSE、VEGF with Clinical pathological Characteristics in Gastric Carcinoma

CHEN jinzhang，XIE jianming，LI aimin，ZHENG dayong，ZHENG hang，LUO rongcheng

【ABSTRACT】 OBJECTIVE:To investigate the expression of heparanase （HPSE），Vascular endothelial growth factor（VEGF） in gastric cancer and their relationship with clinical pathologic characters and with survival， and to discuss the feasibility of HPSE、VEGF as prognostic markers. METHODS: The expression of HPSE，VEGF in gastric cancer were studied by immunohistochemical technique with their relation to follow up data， analyzed their detect outcome with clinical pathologic characters. RESULTS:（1）HPSE and VEGF proteins were detected in 57.3%（59/103）and 46.6%（48/103）amongst the 103 tissue samples of gastric adenoma patients，respectively.Both proteins were undetectable using this method in the 20 healthy control samples.（2）There is no significant correlation between HPSE，VEGF protein expression and the patients’ gender，age，size and site of the tumor and the degree of differentiation（p>0.05）.HPSE and VEGF protein expressions correlate with tumor’s infiltration depth，lymph node metastasis，distal metastasis and pathological stages（p<0.05）.（3）The median survival time for patients with HPSE or VEGF protein expression is 11.0 months and 12.0 months respectively. The difference is statistically significant（p<0.05）compared to HPSE or VEGF negative patients whose median survival time is 70.0 months and 60.0 months respectively.（4）The expressions of HPSE and VEGF proteins are positively correlated in gastric cancers（r=0.675，p<0.05）.CONCLUSION:The results suggest that the high expression of HPSE，VEGF is an useful tool for providing information about the malignant degree， prognosis ，and may be as a gaiding in targeted therapy selection for patients with gastric carcinoma.

【关键词】 胃癌；HPSE；VEGF；免疫组化

［KEY WORDS］ gastric carcinoma；HPSE；VEGF；Immunohistochemistry

胃癌是世界上发病率较高的恶性肿瘤，目前暂且缺乏开展胃癌筛查及早期诊断方法，因此大部分胃癌患者到了晚期才得以诊断^[1]。手术、放化疗等治疗方法虽然是目前常用的治疗手段，但是并不能显著改善胃癌患者预后，提高晚期胃癌患者的生存时间，因此提高胃癌的早期诊断率、寻找新的有效的治疗靶点和预后指标，是当前胃癌研究的重要方向。本研究应用免疫组化的方法检测并分析类肝素酶（Heparanase，HPSE）和血管内皮生长因子（Vascular Endothelial Growth Factor，VEGF）在胃腺癌组织和正常胃粘膜组织中的表达情况及临床意义，拟探讨其与胃癌的临床病理参数和预后的关系及其临床应用的价值，为胃癌的临床诊断、治疗和预后判断提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 材料 

1.1.1 标本

    对2000年1月~2004年1月在南方医院手术切除并经病理确诊为胃腺癌的225例患者进行随访，随访截止至2006年1月，随访时间为2～6年。将有随访结果并且标本资料完整（有完整原癌病灶、淋巴结和癌旁组织）的103例胃腺癌组织作为实验组，从103例胃腺癌患者的正常切缘组织中随机抽取20例作为对照组。实验组样本取自男性67例、女性36例，年龄31～78岁，平均57.97±12.28岁。对照组中男性13例、女性7例，年龄32～72岁，平均57.95±11.83岁。

1.1.2 试剂  

    试剂均购自福州迈新生物技术开发公司，MAB-0243 Mouse  Anti-VEGF购自福州迈新生物技术开发有限公司，BA1630 Rabbit Monoclonal anti-HPA购自武汉博士德生物工程有限公司。

1.1.3 仪器  

    石蜡切片机（山东 AS325）；显微镜（Olympus BX40）；电热恒温干燥箱（56～65℃，上海跃进医疗器械一厂，标准号：ZBY149-83，型号：GZX-DH-50×55）。

1.2 方法  

    免疫组化采用EliVision^TM二步法，具体操作步骤如下：⑴65℃烤片2～4小时；⑵石蜡切片脱蜡至水；⑶蒸馏水冲洗2分钟；⑷抗原修复：本实验用法为浸泡于枸橼酸盐缓冲液（PH 6.0）中，在功率850W的微波炉中加热11分钟，放至室温后用蒸馏水冲洗2分钟；⑸浸泡于3％H₂O₂中，在功率350W的微波炉中加热2分30秒，以消除内源性过氧化物酶的活性；⑹蒸馏水冲洗2分钟；⑺PBS冲洗，2分钟×3次；⑻滴加适当比例稀释的一抗或一抗工作液，37℃孵育1小时；⑼PBS冲洗，2分钟×3次；⑽滴加试剂1（polymer helper），37℃孵育20分钟；⑾PBS冲洗，2分钟×3次；⑿滴加试剂2（poly peroxidase-anti-mouse/rabbit IgG），37℃孵育30分钟；⒀PBS冲洗，2分钟×3次；⒁DAB显色5分钟；⒂自来水充分冲洗，复染；⒃脱水，透明，封片。

1.3 结果判断  

    每批实验设阳性和阴性对照。阴性：细胞膜无棕黄色颗粒样沉淀；阳性：细胞膜有棕黄色颗粒样沉淀。染色分级：整张切片无一个阳性细胞（－）；阳性细胞数<10%（＋）；阳性细胞数10%～50%（＋＋），阳性细胞数>50% （＋＋＋）。

1.4 统计学处理  

    采用χ2检验和Fisher's精确概率法，对HPSE、VEGF蛋白表达与各临床病理参数之间的关系进行统计学分析；采用Kaplan-Meier法，对HPSE、VEGF蛋白表达与生存期的关系进行统计学分析；生存期曲线显著性的比较用Log Rank（Mantel-Cox）法进行分析；各项指标表达的相关性以Spearman等级相关分析的双侧检验；以COX回归对各项指标单因素或多变量联合与生存期的关系进行统计学分析。

2 结 果

2.1 HPSE、VEGF蛋白在胃癌中的表达  

    HPSE、VEGF阳性反应信号主要位于胞膜，少部分位于胞质，其表达呈明显的异质性。HPSE、VEGF在20例胃正常组织中均无表达。103例胃癌组织中HPSE、VEGF阳性表达率分别为57.3％（59/103）、46.6％（48/103）。（图1）

图1 胃癌组织中HPSE和VEGF的表达

A：中分化腺癌，HPSE 0级表达（EV法，原放大倍数：×200）；B：高分化腺癌，HPSE 1级表达（EV法，原放大倍数：×200）；C：中分化腺癌，HPSE 2级表达（EV法，原放大倍数：×200）；D：中分化腺癌，HPSE 3级表达（EV法，原放大倍数：×200）；E：中分化腺癌，VEGF 0级表达（EV法，原放大倍数：×200）；F：中分化腺癌，VEGF 1级表达（EV法，原放大倍数：×200）；G：中分化腺癌，VEGF 2级表达（EV法，原放大倍数：×200）；H：高分化腺癌，VEGF 3级表达（EV法，原放大倍数：×200）

2.2 HPSE、VEGF蛋白表达与胃癌临床病理特征间的关系  

    HPSE、VEGF蛋白表达与患者的性别、年龄、肿瘤大小、部位、分化程度均无显著性相关（P>0.05），与肿瘤浸润深度、淋巴结转移、远处转移及临床分期相关（P<0.05）。

2.3胃癌HPSE、VEGF蛋白表达与生存时间的关系   

    HPSE、VEGF蛋白表达阳性患者中位生存时间分别为11.0个月、12.0个月，阴性患者中位生存时间分别为70.0个月和60.0个月；HPSE、VEGF表达阳性患者与阴性患者生存时间有显著性差异（P＜0.05）。

2.4胃癌中HPSE蛋白表达与VEGF蛋白表达的相关性

    胃癌中HPSE蛋白表达与VEGF蛋白表达呈正相关，相关系数r=0.675（P＜0.05）。

3 讨 论

    许多研究证明，HPSE和VEGF是肿瘤细胞扩散、转移以及预后的指标^[1-5]。我们的回顾性研究正好验证了这个过程。

HPSE是一种能裂解糖氨聚糖中HS侧链的内切糖苷酶，在肿瘤细胞的侵袭、转移及血管生成等过程中起着极其重要作用，是肿瘤细胞扩散与转移过程中的一个关键酶，也是裂解连接于 HSPGs 核心分子上硫酸肝素的一类内切糖苷酶，是抗肿瘤的理想靶点^[1]。Takaoka等用RT-PCR检测胃癌组织中HPSE的表达发现，正常胃粘膜组织中无HPSE的表达，胃癌组织中HPSE的表达与肿瘤体积和局部淋巴结转移有明显正相关性。HPSE高表达的患者预后差。

VEGF是重要的促血管生成因子，在肿瘤血管形成中起重要作用。应用斑点杂交和原位杂交方法已发现，卵巢癌、肺癌、结肠癌、直肠癌、肾癌、乳腺癌、膀胱癌、胰腺癌、胃癌、肝癌、恶性胶质瘤和淋巴瘤等肿瘤组织内VEGF mRNA 呈过度表达，肿瘤细胞分泌的VEGF最终通过和内皮细胞上的受体结合而发挥作用。研究还发现VEGF是恶性肿瘤治疗的一个有效靶点，在临床上起到一定作用^[1]。

本研究中发现，HPSE蛋白与VEGF蛋白在胃癌组织中的阳性表达率较高，而在胃正常组织组织中呈阴性表达。HPSE和VEGF的表达越高，相应肿瘤患者的肿瘤侵袭浸润能力更强、转移能力也增强，与文献报道的相似^[6-8]。我们在数据分析中还发现，胃癌组织中HPSE蛋白与VEGF蛋白的联合表达与生存期相关，二者的阳性表达有减少胃癌患者生存时间的危险。同时检测HPSE、VEGF蛋白在胃癌中的表达，对判断胃癌的恶性潜能有重要的参考价值，对判断胃癌预后有重要的意义。

    如果能研制出同时针对以HPSE和VEGF为靶点的药物，那么不仅可以丰富胃癌治疗的方法，而且应该可以改善胃癌患者的预后，提高晚期胃癌病人的中位生存期。

参考文献

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[ 2 ] 吴坚美，姜金波．VEGF-C 和 VEGF-D 在胃癌及相关淋巴结组织中表达和临床意义的研究[ J ]．中华肿瘤防治杂志，2007，14（8）：590 - 592．

[ 3 ] Shida A，Fujioka S，Kobayashi K，et al．Expression of vascular endothelial growt h factor （VEGF）-C and-D in gastric carcinoma [J ]．Int J Clin Oncol，2006，11（1）：38-43．

[ 4]李健，沈琳等．胃癌组织中VEGF-C与VEGF-D 及受体23 的表达及其临床病理意义的研究[J ]．中华肿瘤防治杂志，2008，15（7）：514 - 517．

[5]姚宏，平苏萍，张庆升等．肝素酶和碱性成纤维细胞生长因子与大肠癌转移和预后关系工作报告•中国药物与临床，2005，5（10）：742-746．

[6]Gohji K，Okamoto M，Kitazawa S，et al．Heparanase protein and gene expression in bladder cancer [ J ]．Urol，2001，166（4）：1286-1290．

[7]Zcharia E，and Zamir E．Molecular properties and involvement of heparanase in cancer progression and mammary gland morphogenesis mam mary gland[J]．Biology Neoplasm，2001，6：311-322．

[8]Cong B，Zhao X，Zhao XG，et al．Relation of vascular endothelial growth factor-D expression to microvessel density，microlymphatic vessel density，and lymphnode metastasis of lung adenocarcinoma[J]．Zhonghua Yi Xue Za Zhi，2008，88（31）：2179-2182．

第一作者简介：陈锦章，男，广东南澳人，硕士，主要从事恶性肿瘤生临床治疗

 Tel：86-20-62787745  E-mail：chenjinzhang@hotmail.com

通讯作者简介：罗荣城，男，广东普宁人，硕士，教授，博士生导师，主要从事恶性肿瘤生物治疗的基础与临床研究   

Tel：86-20-61641651  E-mail：luorc01@163.com