卢健^1,2 王丽娜¹ 马骥^1*  范颖¹ 林蔗茹¹

（1辽宁中医药大学方剂学科 沈阳 110032；2辽宁中医药大学职业技术学院 沈阳 110101）

摘要：目的：探讨四逆散对实验性UC大鼠TNF-α和IL-10的影响，以及君臣配伍在组方中的作用。方法：将实验动物分为5组，采用免疫法造模，用ELISA法检测大鼠结肠粘膜组织和血清TNF-α和IL-10水平。结果：模型组实验大鼠血清和TNF-α明显高于正常组，IL-10均显著低于正常组；经给药后，四逆散组、柴芍枳组和柴芍组实验大鼠血清TNF-α显著低于模型组，四逆散组和柴芍组实验大鼠血清IL-10明显增加，以四逆散组增加最为显著；而灌服柴芍枳后，实验大鼠血清IL-10水平与模型组比较无明显差异。结论：四逆散能够抑制促炎因子TNF-α的分泌，促进抗炎因子IL-10的分泌，调节促炎因子和抗炎因子之间的平衡，从而干预实验性UC；方中君、臣药物的配伍作用尤为突出，在全方中占有重要地位。

关键词：四逆散；TNF-α；IL-10；溃疡性结肠炎；实验

Study on Sini Powders Influence on TNF-α and IL-10 of

Experimental Ulcerative Colitis Rats

Abstract: The study is Sini Powders influence on TNF-α and IL-10 of experimental UC rats and effect of monarch drug and ministerial drug in the prescription. The experimental animals are divided into 5 groups and modeled with immunization. Through detecting TNF-α and IL-10 levels of rats’ colon mucosal tissue and serum with ELISA, find TNF-α levels of model group higher than normal group, and IL-10 levels lower than normal. After feeding experimental herbal medicine, TNF-α levels of UC rats obviously decrease, and IL-10 levels increase, especially Sini Powders. But after feeding, Chaishaozhi, IL-10 levels of UC rats have no difference with model group. So we speculate that Sini powders can intervene in experimental UC with suppressing TNF-α and promoting IL-4 secreting to adjust the balance between Pro-inflammatory and anti-inflammatory cytokines. The compatibility of monarch drug and ministerial drug play an important role.

Keywords: Sini Powders; TNF-α；IL-10; Ulcerative Colitis; Experiments

溃疡性结肠炎（ulcerative colitis, UC）以持续或反复发作的腹泻、粘液脓血便为主要症状，其发病机制目前尚不明确。大量的临床与实验研究表明，由于UC患者和实验动物的血清与结肠粘膜TNF-α水平的增加和IL-10水平的降低，造成促炎因子和抗炎因子之间的平衡紊乱，进而导致机体和肠道免疫系统功能紊乱，发生炎症反应，形成溃疡^[1-2]

本课题组通过前期对四逆散不同配伍干预实验性UC的效用研究，认为四逆散能够干预实验性UC，其作用以四逆散全方最为理想，柴胡、芍药发挥了君药与臣药的重要配伍作用。本实验在此基础上，进一步探讨四逆散对实验性UC大鼠TNF-α和IL-10的影响，以期探究四逆散干预UC的作用机制以及君臣配伍在组方中的作用。

1材料

1.1四逆散：由柴胡、芍药、枳实、甘草以1：1：1：1比例组成。柴胡免煎颗粒（0909165）、芍药免煎颗粒（0909053）、枳实免煎颗粒（0909086）、甘草免煎颗粒（0909050）均购自江苏省江阴天江药业有限公司。

1.2实验动物：健康SD大鼠（SPF级，00800161042）50只，雌雄各半，体重160-190g，由上海西普尔-必凯实验动物有限公司提供，许可证编号：SCXK（沪）2008-0016。根据“四逆散不同配伍干预实验性溃疡性结肠炎的效用研究”的实验结果，将实验动物分为五组：正常组、模型组、四逆散组、柴芍枳组和柴芍组，每组10只，各组体重统计学比较无显著差异。

1.3主要试剂：蛋白标准液、考马斯亮兰溶液均购自南京建成生物工程公司；完全福氏佐剂购自美国SIGMA公司；大鼠血TNF-α、IL-10检测试剂盒购自北京邦定生物医学公司。

1.4主要仪器与设备：550型酶标仪（美国BLO-RAD公司）；TDL-5-A型离心机（飞鸽牌Anke）（上海安亭科学仪器厂）；WS2-261-79型电热恒温水浴箱（北京长安科学仪器厂）；DY89-Ⅱ型电动玻璃匀浆机（宁波新芝生物科技股份有限公司）。

2方法

2.1造模方法：采用免疫法造模^[3]。刮取家兔新鲜结肠粘膜制成组织匀浆，将其以4000r/min速度离心30min，取上清液提纯，用Lowry法测定蛋白质含量，冷藏备用。使用时与等量完全福氏佐剂充分混匀，制成抗原乳化液。于造模第1d注射抗原乳化液，分别注射于大鼠的双侧足跖、腹股沟及背部，每只约需0.5ml；第10、17、24d依同法注射。按1ml/100g体重的浓度分别配制灌胃药物，于造模第2d开始分组灌胃。于第29d灌胃后，称重，麻醉后于腹主动脉取血，待侧指标。

2.2指标检测：采用双抗体夹心ELISA法测定，严格按试剂盒要求操作。从冰箱取出大鼠血清；取出酶标板，依照次序对应分别加100μl的标准品于空白微孔中；分别标记样品编号，加100μl样品于空白微孔中；在标准品孔和样品孔中加50μl的酶标记溶液；36.2℃孵育反应60min；手工洗板6次，每次静置25s；每孔加底物A、B液各50μl；36.2℃避光孵育反应15min；每孔加50μl终止液，终止反应6min；放入酶标仪中检测，采集数据。

2.3统计：采用统计软件SPSS10.0处理，实验数据以平均值士标准差(±s)表示，组间均数比较采用单因素方差分析。

3结果

3.1四逆散对实验性溃疡性结肠炎大鼠血清TNF-α的影响：与正常组比较，模型组、四逆散组、柴芍枳组和柴芍组实验大鼠血清TNF-α的含量均明显高于正常组（P＜0.01，P＜0.05， P＜0.05， P＜0.01）；与模型组比较，四逆散组、柴芍枳组和柴芍组显著降低，P＜0.01；四逆散组、柴芍枳组和柴芍组之间比较无统计学意义。实验结果详见表1。

3.2四逆散对实验性UC大鼠血清IL-10的影响：与正常组比较，模型组、四逆散组、柴芍枳组和柴芍组实验大鼠血清IL-10的含量均明显降低，P＜0.01；给药后，柴芍枳组与模型组比较无显著性差异，而四逆散组和柴芍组大鼠血清IL-10明显高于模型组，P＜0.01，其中，柴芍组明显低于四逆散组，P＜0.01。实验结果详见表1。

表1 四逆散对实验性UC大鼠血清TNF-α和IL-10的影响

与正常组比较：a：P＜0.05；b：P＜0.01；与模型组比较：c：P＜0.05；d：P＜0.01

与四逆散比较：e：P＜0.05；f：P＜0.01

4讨论

4.1肿瘤坏死因子（tumor necrosis factor，TNF）是1975年Carswell等发现的由Th1细胞分泌的一种重要的促炎细胞因子。TNF以两种分子形式存在，即TNF-α和TNF-β。TNF-α是一种单核因子，主要由单核-细胞产生；TNF-β是一种淋巴因子，主要由活化的T淋巴细胞分泌。两者结构相似，具有极为相似的生物学活性。TNF-α能激活血管内皮细胞，引起肠道组织学改变，导致组织水肿、上皮损伤及出血；表达多种细胞因子和黏附分子，引发一系列炎性细胞浸润和炎症反应，介导粘膜损伤，其抑制剂可阻断局部肉芽肿性炎和纤维细胞增生^[4]，在UC发病中起着重要作用。

TNF-α参与UC致病作用的主要机制为：①损伤粘膜组织：参与诱导粘膜微血栓形成，导致粘膜微循环障碍；抑制结肠上皮细胞的生长，杀伤上皮细胞，损伤结肠粘膜；促进结肠粘膜血小板活化因子的释放，扩张血管，使结肠粘膜组织充血水肿^[5]。②启动免疫反应：增强主要组织相容性抗原I和Ⅱ类、上皮细胞粘附分子的表达，启动免疫反应；启动T、B淋巴细胞活化，同时调节巨噬细胞和中性粒细胞的增生、成熟、活化，促进其粘附、游走和脱颗粒^[6]。③放大炎症效应：上调血管内皮细胞的粘附分子和趋化性细胞因子的表达，使中性粒细胞等炎症细胞聚集增加；激活核转录因子NF-kB，启动基因转录，使IL-lβ、TNF-α等促炎因子过量表达，形成炎症放大效应^[7]。

临床研究证明，UC患者肠粘膜存在不同程度的巨噬细胞浸润，TNF-α含量与粘膜炎症程度呈正相关；活动期UC患者血清中的TNF-α浓度明显高于非活动期UC患者，血清TNF含量可作为临床观察UC患者预后的指标之一^[8]。

实验结果表明，模型组大鼠血清TNF-α明显高于正常组（P＜0.01）。经给药后，四逆散组、柴芍枳组和柴芍组实验大鼠血清TNF-α呈下降趋势，显著低于模型组。说明四逆散及其柴芍枳、柴芍配伍均能通过降低血清TNF-α含量干预实验性UC。

4.2白细胞介素-10（interleukin-10，IL-10）是Fiorentino等于1989年首先发现的由Th2细胞产生的抗炎性细胞因子。IL-10由Th2细胞、单核巨噬细胞和B细胞等多种细胞分泌，其主要生物学活性表现为免疫抑制作用和抗炎作用。IL-10是活化的Th2细胞产生的一种活性物质，能抑制Th1细胞的激活，改变机体的免疫应答反应，介导Th1和Th2两类细胞之间的相互调节^[9]；强烈刺激抗原特异性B细胞的增殖和分化；抑制单核-巨噬细胞、中性粒细胞等分泌促炎细胞因子TNF-α、IL-1β等。

临床研究表明，UC患者血清中IL-10水平升高，使UC患者外周单核细胞分泌TNF-α减少，其水平与疾病活动度密切相关^[10]；有研究认为IL-10可能是UC的保护性因素，可以用UC患者结肠粘膜IL-10水平反应疾病的活动情况和转归^[11]。

实验结果表明，模型组实验大鼠血清IL-10均显著低于正常组（P＜0.01）。经给药后，四逆散组和柴芍组实验大鼠血清IL-10明显增加，以四逆散组增加最为显著；而灌服柴芍枳后，实验大鼠血清IL-10含量与模型组比较无明显差异。说明四逆散能够促进实验性UC大鼠IL-10的分泌，以全方的作用最优；另外，柴芍配伍在四逆散促进IL-10的分泌的过程中发挥了重要作用，配伍枳实后，作用降低。

综合分析本实验结果，四逆散能够抑制促炎因子TNF-α的分泌，促进抗炎因子IL-10的分泌，调节促炎因子和抗炎因子之间的平衡，从而干预实验性UC。方中君、臣药物的配伍作用尤为突出，在全方中占有重要地位。

5结论

5.1四逆散能够抑制促炎因子TNF-α的分泌，促进抗炎因子IL-10的分泌，从而干预实验性UC。方中君、臣药物的配伍作用尤为突出，在全方中占有重要地位。

5.2通过对促炎因子的抑制作用和对抗炎因子的促进作用，调节促炎因子和抗炎因子之间的平衡，可能是四逆散干预UC的机制之一。

参考文献：

[1]Gustot T，Lemmers A，Louis E，et al. Profile of soluble cytokine receptors in Crohn’s disease[J].Gut，2005，54（4）：488-495

[2]Saniabadi AR，Hanai H，Suzuki Y，et al. Adacolumn for selective leukocyte-pheresis as a non-pharmacological treatment for patients with disorders of the immune system: an adjunct or an alternative to drug therapy [J].J Clin Apher，2005，20（3）：171-184

[3]徐叔云，卞如濂，陈修.药理实验方法学[M].3版，北京：人民卫生出版社，2002：1335

[4]Sivakamar PV，Westric GM，Kanaly S，et al. Interleukin 18 is a primary mediator of the inflammatory associated with dextral sulphate sodium induced colitis-blocking interleukin 18 attenuates intestinal damage [J]. Gut，2002，50（6）：812，20

[5]张可，邓长生，朱尤庆.溃疡性结肠炎组织中NF-kB，cox-2和iNOS表达的意义[J].世界华人消化杂志，2002，10（5）：575-6

[6]祝斌，李巧勤，陈垦，等.溃疡性结肠炎患者周围血中性粒细胞凋亡与细胞因子水平的关系[J].临床消化病杂志，2003，（6）：254-256

[7]Bonizzi G，Karin M. The two NF-kB activation pathways and their role in innate and adaptive immunity[J].Trends Immuno1，2004，25：280-288

[8]朱萱萱.肠安胶囊治疗大鼠免疫性溃疡性结肠炎的实验研究[J].中国中医药科技，2002，9（1）：19

[9]Mosmann TR，Moore K. The Role of IL-10 in Cross Regulation of Th1 and Th2 Responses[J]. Immunology Today，1991，12（3）：49

[10]Schreiber S，Heinig T，Thiele HG，et al. Immunoregulatory role of interleukin 10 in patients with inflammatory bowel disease[J].Gastroenterology,1995，108：1434-1444

[11]Cui HH，Chen CL，Wang JD，et al. Effect sofprobiotic on intestinal mucosa of patients with ulcerative colitis[J].World J Gastroentero，J 2004，10(10)：1521-1525

注：

基金资助：辽宁省教育厅项目（2006T094）：古代经典方剂配伍的生物效应及物质基础研究

通讯作者：马骥，教授，方剂学博士生导师，024-31207028

作者简介：卢健，讲师，方剂学博士在读，研究方向：方剂效用机理