安传伟¹，石广娅^,2，安传相³，李红敏¹，叶建¹，计策¹，何光志^2*

（1，贵阳中医学院时珍学院中西医 2，贵阳中医学院 3，贵阳学院2011级生物工程 

摘要：目的 研究中药银杏抗菌提取物对临床常见致病菌株金黄色葡萄球菌的抗菌活性。方法 本研究通过提取银杏抗菌成分分离提取，使用纸片扩散法和常量肉汤稀释法，选用临床上常见的致病菌株金黄色葡萄球菌 (标准型 ATCC25923)进行体外药敏实验。结果 银杏抗菌提取物对金黄色葡萄球菌的最小杀菌浓度 (MBC)为 0.9375mg/ml。结论 银杏抗菌提取物对临床致病菌株金黄色葡萄球菌表现出良好的杀菌作用，银杏在抗感染治疗领域具有较好的开发和应用前景。

关键字：银杏果仁；耐甲氧西林金黄色葡萄球菌；药敏实验   

[项目资助] 2011年贵阳中医学院共青团专职团干、大学生科研课题、贵阳中医学院2011年“教学质量与教学改革工程”、2011年贵州省中药管理局课题和2010年度贵州省优秀科技教育人才省长联合资金资助

 银杏(Ginkgo Balboa)起源古老，是世界上珍贵的药用植物，其叶果和外种皮等皆具有药用开发价值。银杏各组织的提取液对病原菌都有一定的抑制作用^[1]，所以银杏树几乎不会感染细菌。近年来，银杏的研究和应用开发成为热点。以银杏为主要原料的系列食用保健品如银杏果茶、银杏保键茶、银杏汁、银杏口服液、银杏保健饮料和银杏啤酒等已经取得专利。银杏果仁资源量大、售价高、销路畅(90%供出口)，表现出明显的经济优势。为此，本研究提取银杏果仁进行了对临床耐甲氧西林金黄色葡萄球菌株进行药物敏感性试验，拟在为深入开发利用银杏这一中药材提供依据。

1 材料与试剂

1.1实验材料 银杏果仁，采自于贵州省凤岗县；耐药性金黄色葡萄球菌株： ATCC25923，由贵阳中医学院微生物实验实验室惠赠。

1.2仪器 粉碎机（BHJ1-BRT20，山东精诚机械有限公司专业生产）、超声波（RS-120S，宁波荣顺科技仪器厂）、台式冷冻干燥机（实用型）（LGJ，郑州

南北仪器设备有限公司）、手提式压力蒸汽灭菌器（ YX-280B(18L) 品牌: 合肥

华泰）和无菌操作台（SYD，中国苏州）和紫外分光光度计（Pharmacia Ultrospec，美国Pharmacia Biotech公司）。

1.3 试剂 EDTA(乙二胺四乙酸), 批号20110316，购自天津金汇太亚化学试剂有限公司。可溶性蛋白提取缓冲液配方：50mmol/L PBS(pH7.0),0.1mol/LKCl，2Mm EDTA。

2. 方法

2.1 银杏果仁中抗菌成分的提取 收集成熟的银杏果仁剥种皮去壳约100g种仁研磨成匀浆，加入可溶性蛋白提取缓冲液(50mmol/L PBS(pH7.0),0.1mol/LKCL，2Mm EDTA)，4℃过夜、过滤，在低温下5000rpm/min离心取上清，置于4℃冰箱保存备用;

2.2 体外抗菌试验　

2.2.1 纸片扩散法试验 将加有15 μl不同浓度的（原始浓度药液120 mg/ml，依次为60、30、15. 7.5、3.75、1.875、0.9375、0.46875、0.234375和0.117188 mg/ml)的圆纸片放在含标准量细菌接种物的琼脂板上, 37℃培养18h，根据药敏纸片周围显出的抑菌圈大小来判断抗菌作用的强弱，通过此法初步筛选敏感细菌。以待进一步测定最小杀菌浓度(minimal bactericidal concentration,MBC) ,设置灭菌蒸馏水及助溶剂对照组(助溶剂羧甲基纤维素钠0.5g, 采用灭菌蒸馏水溶解, 加至50 ml)。

2.2.2肉汤稀释法试验 采用常量肉汤稀释法测定最低抑菌浓度（MIC），用PBS(pH7.0)洗下实验菌落，配制成约为3. 0 ×10⁸ 个/ml的细菌肉汤悬液备用，排列10个试管，每管中加入预备的菌液1 ml，各管终浓度依次配成为60、30、15.、7.5、3.75、1.875、0.9375、0.46875、0.234375和0.117188 mg/ml。第11管为阳性对照组( 1 ml菌液，不加药物) 。在 37 ℃恒温箱培养48 h后，将每一管中含有不同浓度药物的菌液分别接种到Mueller-Hinton（MH）肉汤中，接种后经37 ℃恒温箱继续培养24 h后，根据划线处细菌生长情况判断该种药物的最小杀菌浓度。

3 结果

3.1 纸片扩散法实验结果 每组提取物和细菌配比均进行了3次实验，抑菌圈直径(mm)= 抑菌直径(mm)- 滤纸片直径(6 mm)以取平均抑菌圈直径(mm)获得结果，结果详见表1。

表1　银杏抗菌成分不同浓度纸片扩散法抑菌试验结果

注：1) 纸片直径为6mm， ²⁾抑菌圈直径≥9 mm

3.2常量肉汤稀释法实验结果　　进一步测定最小杀菌浓度，银杏抗菌成分提取物对抗耐甲氧西林金黄色葡萄球菌株的最小杀菌浓度为0.9375mg/ml。试验结果详见表2。

表2　银杏抗菌成分常量肉汤稀释法抑菌试验结果

    注：+细菌生长，—细菌未生长

4讨论

4.1细菌对抗生素耐药情况导致细菌感染导致的病死率增高，医疗费用增加，其后果日益严重。1980年，瑞典科学家Boman等从天蚕蛹的血淋巴中分离得到天蚕素(cecropin)抗菌肽，使人们对抗菌肽的作用机理和应用有了崭新的认识^[2]。抗菌肽(Antimicrobial Peptides)广泛存在于从微生物到动植物生物体内^[3]，具有抵御外界微生物侵害，清除体内突变细胞的小分子抗菌肽^[4-6]，也称之为“第二防御体系”^[7]。

4.2随着研究的深入，人们发现某些抗菌肽对部分真菌、细菌、原虫和病毒具有明显杀伤作用，对癌细胞有攻击作用而不破坏正常细胞^[8]。抗菌肽以其广谱抗微生物，还具有作用快、安全、无残留、能够刺激免疫反应和对环境也有较强的抗性等特点将被广泛的应用在多个领域。

4.3有研究表明：银杏果仁中提取成分具有抑制 HIV-1反转录酶的活性和抑菌杀菌活性^[9-14]；徐立春等报道银杏外种皮石油醚提取物和乙醇提取物对大部分实验真菌敏感^[15]。刘缙等纯化了银杏种仁中的一种抗菌蛋白，并证实该蛋白具有较强抑菌活性，且性质稳定^[16]。本研究通过提取银杏抗菌肽成分，在体外检测提取物对临床耐甲氧西林金黄色葡萄球菌株进行药物敏感性试验，为深入开发利用银杏这一中药材提供依据。

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