王萍，王宁，陈俊林（漯河医学高等专科学校，漯河，462002）  

      摘要：目的探讨姜黄素对人食管癌Ec-9706细胞体外增殖及凋亡的影响。方法：选用人食管癌Ec-9706细胞进行体外培养，采用MTT法测定不同浓度的姜黄素对Ec-9706细胞的增殖抑制作用流式细胞仪监测凋亡；荧光显微镜技术和电镜技术，观察姜黄素对细胞诱发凋亡及细胞周期的变化。SABC免疫组化法检测细胞内Bcl-2、Bcl-XL、Caspase-3蛋白表达水平。结果:姜黄素可明显抑制细胞的生长，其抑制率与药物浓度成剂量依赖关系。流式细胞分析仪结果表明，姜黄素能使Ec-9706细胞在加药后24 h出现凋亡峰。电镜观察可见姜黄素能使细胞发生凋亡，出现核边集及染色质浓缩成块状。Bcl-2、Bcl-XL表达均下调，Caspase-3表达增强。结论：姜黄素可抑制Ec-9706细胞的生长，其机制可能与诱导细胞凋亡有关。上调Caspase-3，

下调Bcl-2、Bcl-XL蛋白的表达，诱导细胞凋亡可能是其作用机制之一。

关键词：姜黄素；Ec-9706细胞；凋亡

Effects of curcumin-induced apoptosis in human colon carinoma cells

WANG  Ping，Wang Ning，Chen Jun Lin,eta1． (Luo He Medical college ,Luo He 462002)

Abstract：0bjective To obserde the effects of curcumin on proliferation and apoptosis in the human esophageal  epithelia Ec-9706 cells ．Methods: Methyl thiazoly1 tetrazollum (MTT)assay was used to detect the cel1 proliferation of Ec-9706 cells．The cell apoptos is and changes of cell cycle of  Ec-9706 cells were analyzed by using flow cytometry。fluorescencemicroscopy and／or electron microscopy．In addition，the expression of Bcl-2、Bcl-XL、Caspase-3 protein in Hela cell were observed by SABC.Results: Curcumin significantly inhibited the ceil proliferation of Ec-9706 cells in dose．dependent manner．The results of flow cytometry showed

that an apoptotic peak was found after Ec-9706 cells treated with curcumin for 24 h．Condensed and highly fluorescent granular cell nuclei under fluorescence microscopy and chromatin condenstation and aggregation on the nuclear margin under electron microscopy were observed in Ec-9706 cells treated with curcumln． The Bcl-2、Bcl-XL expression were decreased while Caspase-3 expression was increased ．Conclusion : Curcumln would inhibit the growth of colon cancer cells and the mechanism responsible for the effect might be involred in the induction of apoptos -is cells；inducing apoptosis through up regulating Caspase-3 and down regulating expression of  Bcl-2、Bcl-XL is probably one of its molecular mechanisms．

Key words：curcumin；Ec-9706 cells；apoptosis

姜黄素是从姜科姜黄属植物姜黄根茎中提取的一种酚性色素，由于其色泽稳定且毒性低，目前已广泛应用于食物添加剂和染料中。已有研究表明其具有抗炎、抗氧化、抗凝、抗病毒的作用，尤其是它的抗肿瘤作用备受关注，成为研究的热点。体外实验显示姜黄素能够诱导多种细胞株的凋亡^[1]。但对食管癌细胞的作用则报道较少。本文观察了姜黄素对人宫食管癌细胞株Ec-9706体外增殖及凋亡的影响。

1  材料与方法

1.1  材料

    人食管癌细胞株  由郑州大学基础医学院病理生理教研室提供，姜黄素为美国Sigma公司产品，稀释成5×10³μmol/L，置于一20℃保存，临用前解冻。SABC试剂盒、鼠抗人Bcl-2、Bcl-XL、Caspase-3均购自为武汉博士德公司产品。

1.2  方法

1.2.1  细胞的培养  将细胞接种在50ml培养瓶中，用含10％小牛血清的RPIM1640培养液，37℃ ，5％二氧化碳培养箱内培养。细胞贴壁80％时传代，1周大约2次。

1.2.2   MTT法检测细胞生长抑制率  取对数生长期细胞5×10⁴ 个／ml，每孔0．2ml，接种于96孔组织培养板中，设PBS对照组和不同浓度(5-50μmol/L)的实验组，各设3个复孔。置37℃ 、5% C02培养箱中培养，分别作用6h、12h、24h、48h，实验终止前4h每孔加MTT(5mg／m1)工作液20μl，上机前除去培养液，每孔加200μl二甲基亚砜，在酶标仪(570nm波长)上测量各孔吸光度值(OD值)，按下列公式计算细胞生长抑制率。

抑制率( % )=(1—实验组平均OD值／对照组平均OD值)×100%

1.2.3  流式细胞仪(FCM)分析细胞周期  用10、25、50μmol/L的姜黄素处理的Ec-9706细胞用70％乙醇固定48h，PBS缓冲液洗去固定液。用缓冲液37℃ 孵育60min，抽取小分子DNA，

然后加入碘化丙啶PI染色液，4℃避光染色20min后上机进行细胞周期的测定。

1.2.4  透射镜下观察细胞形态   25μmol/L的姜黄素作用Ec-9706细胞48h，收集细胞，PBS洗2次，离心，用2.5％戊二醛固定细胞团，继续用2％ 四氧化锇固定，脱水、包埋、切片和染色按常规处理，用H一600型透射电镜观察细胞超微结构。

1.2.5  Bcl-2、Bcl-XL、Caspase-3蛋白水平的检测  25μmol/L的姜黄素加入对数生长期的  细胞，孵育48h后，冷丙酮固定，采用免疫组化SABC法(按试剂盒说明书操作)，最后经DAB显色，以PBS代替一抗作阴性对照。结果判断：光镜下，Bcl-2、Bcl-XL、Caspase-3表达阳性。细胞的胞浆内呈现特异性棕褐色。

阳性表达率=(阳性细胞数／500个瘤细胞)×100％。

2  结果

2.1  姜黄素对HT一29细胞增殖的影响  随着药物浓度的增加，姜黄素对Ec-9706细胞的抑制率逐渐加强，即存在着剂量依赖关系。经5、10、25、50μmol/L的姜黄素处理24、48、72h，Ec-9706细胞生长均不同程度地减慢，并呈时间、浓度依赖性，与对照组相比，各浓度姜黄素作用72h后，Ec-9706细胞生长抑制率分别为15.6%、31.2%、54.4%及81.5%。统计学结果显示不同时间之间差异均有显著性(P<0．01)，而与对照组相比，差异有显著性(P<0．01).见表1。

表1 姜黄素对Ec-9706细胞增殖的一致效应（±S)

注：*与对照组（未用药处理组）比较，P<0.01

2.2  姜黄素对Ec-9706细胞周期的影响  正常状态下，癌细胞大多处于G₁期，S期次之，G₂／M期最少。对照组DNA组方图为典型肿瘤细胞的G₀／G₁、S、G₂／M峰型。从表2可以看出，细胞周期发生明显变化。Go／G₁期比例降低，S期、G₂／M期比例均增高，呈剂量依赖关系。提示姜黄素可阻断癌细胞从Go／G₁期到S期的发展。姜黄素对Ec-9706细胞周期分布和细胞凋亡率作用结果显示，对照组凋亡率很低，而浓度为10、25、50μmol/L的姜黄素作用48h，凋亡率分别为11．86％,l2.26％、23．3％。且可以观察到s期细胞也随着浓度增加而明显增加。见表2。

表2 姜黄素对HT一29细胞凋亡和细胞周期的影响

2.3   透射电镜观察细胞超微结构 透射电镜下可见姜黄素处理组细胞与对照组细胞比较，处理组细胞体积变小，细胞核边集(图1)，同时可见细胞内染色质浓缩并凝结成块。

未发生凋亡的细胞              发生凋亡的细胞

图1 透射电镜下细胞的超微结构

2.4  姜黄素对Bcl-2、Bcl-XL、Caspase-3表达的影响

   25μmol/L的姜黄素处理48h后，发现Ec-9706细胞的Bcl-2、Bcl-XL表达减弱，Caspase-3表达增强。处理组与对照组表达率比较有显著差异(P<0．05)。见表3。

表3 免疫组化检测姜黄素对Bcl-2、Bcl-XL、Caspase-3表达率的影响

与对照组相比，P<0．05

3  讨论

    本文主要从诱导细胞凋亡这个角度探讨姜黄素抗肿瘤作用机制。从实验结果可知，姜黄素对Ec-9706细胞有较强的抑制作用，并随剂量增加，细胞毒作用增强，即存在量效依赖关系，与Cole等报道的结果一致。实验中流式分析仪的结果表明：S期的细胞明显增加，而G0／Gl期和G2／M 期细胞数量均减少，这说明姜黄素能使Ec-9706细胞堆积于DNA合成期，不能有效地进入下一个细胞周期的分期，即G₂／M 期。Sigh等研究发现，姜黄素是通过抑制胸腺嘧啶脱氧核苷激酶的活性将细胞有效地阻滞于S期。从而阻断了细胞的生长、分裂，延长了细胞周期，达到抑制肿瘤生长的目的。FCM 的结果还发现给药组有凋亡峰出现，透射电镜下可见给药组出现典型的凋亡特征，荧光显微镜观察的结果也显示姜黄素Ec-9706细胞凋亡，并呈现剂量依赖关系。尽管有关姜黄素诱导细胞凋亡的结论存在分歧。但多数报道^[2-6]趋于一致，即姜黄素不仅具有细胞毒作用，还可诱导肿瘤细胞凋亡。

    本研究证实了姜黄素可以通过细胞毒作用、诱导细胞凋亡以及影响细胞周期使肿瘤细胞生长延迟或逐渐走向死亡。有关姜黄素影响凋亡相关基因的表达、诱导肿瘤细胞的分化以及对细胞信号传导的作用的研究正在不断地深入。相信在不久的将来，它将成为一种高效、低毒的抗肿瘤药物，广泛地应用于临床。

参考文献

[1] Inano H，Onada M，Inafuku N，et a1．Potent preventive action of curcumin on     radiation—induced initation of mammary tumorigenesis in rats[J]．Carcinogenesis，2000；21：1835—1841．

[2] 陈宏，张振书，张亚历，等．姜黄索对大肠癌细胞周期的影响[J]．胃肠病学和肝病学杂志。2000，9(2)：107—109．

[3] 厉红元。车艺。汤为学．姜黄索对人肝癌细胞增殖和凋亡的影响[J]．中华肝病杂志，2002，10(6)：449—451．

[4] Chen H，Zhong ZS。Zhong YL。et a1．Curcumin inhibits cell proliferation

by interfering with the cell cycle and inducing apoptosis in colon

carcinoma ceUs[J]．AnticancerRes，1999，19(5A)：3675—3680．

[5] Singh AK。sidhu GS，Deepa T，et a1．Curcumin inhiits the proliferatio

and ceil cycle progression of human umbilical vein endothelial cellcJ]．

Cancer Lett。1996，107(1)：109—115．

[6]Pal S，Choudhuri T，Chattopadhyay S，et a1．Mechanisms of curcumin．

induced apoptosis of Ehrlich sascites carcinoma ceils[J]．Biochem Bio—

phys Res Commun。2001，283(3)：658—665．

作者介绍：王萍(1980一 )，女，硕士,主要研究方向：肿瘤病理生理,联系方式：15939548848。