刘  春  徐  亮₂   张  瑜₁  陈  科₁  王一兴₁谢  云₁

 【摘要】目的：利用表面增强激光解析离子化飞行时间质谱仪（Surface-enhanced laser desorption-ionization time-of-flight mass spectrometry, SELDI-TOF-MS）及其配套蛋白质芯片筛选乳腺癌生物学标记物，初步探讨其在乳腺癌诊断中的临床意义。方法：用美国Ciphergen公司研制的蛋白指纹图谱仪和蛋白质芯片检测30例乳腺癌患者、30例乳腺纤维瘤患者、30例正常人血清蛋白质的相对含量，用SPSS 11.5软件分析处理数据，筛选标志物，建立诊断模型。结果：在乳腺癌、乳腺纤维瘤患者和正常人中共发现3个差异有统计学意义的蛋白质峰表达，质荷比（m/z）分别为：5 700 Da、8 900 Da、5 910 Da和3 933Da。用于乳腺癌诊断灵敏度和特异度分别为86.7％和96.7％。结论：蛋白指纹图谱技术在乳腺癌的早期诊断及筛选生物学标记物等方面有很大的价值，值得进一步研究及推广应用。

【关键词】乳腺癌；蛋白质组学；血清标志物；表面增强激光解析离子化飞行时间质谱；诊断

【中图分类号】R604    【文献标识码】A

The Clinical Significance of  Screening Serum Protein Fingerprint in Breast Cancer 

Liu Chun,etal. General Surgery Department ,the Second People’s Hospital of Neijiang in Sichaun Province，Neijiang,641000;.

Xu Liang, General Surgery Department ,the Affiliated Hospital of the Luzhou Medical College, Luzhou;  646000

【Abstract】Objective:To detect the serum protein fingerprint in breast cancer patients by using the surface-enhanced laser desorption-ionization time-of-flight mass spectrometry (SELDI-TOF-MS) and protein chip array technology, screen biomarker candidates, build diagnostic models and evaluate its clinical significance. Methods:The serum proteomic patterns were detected in 30 patients with breast cancer, 30 patients with breast adenofibroma and 30 healthy blood donors）. The diagnostic models were developed and validated by discriminant analysis. Results:The peak intensity of 5 700 Da、8 900 Da、5 910 Da (m/z) proteins was significantly higher in 30 breast cancer patients than that in 30 breast adenofibroma patients and 30 healthy blood donors. The three differential expression proteins are set up a diagnostic model together to diagnose breast cancer. The diagnostic model made up of the differential expression proteins of 5 700 Da、8 900 Da、5 910 Da had a sensitivity of 86.7％ and a specificity of 96.7％.Conclusion  Using the surface-enhanced laser desorption-ionization time-of-flight mass spectrometry (SELDI-TOF-MS) showed great potential to detect, and screen novel and better biomarkers for breast cancer.

【Key words】Breast cancer；Proteomics；Serum marker；Surface-enhanced laser desorption-ionization time-of-flight mass spectrometry；Diagnosis

乳腺癌是女性常见的恶性肿瘤之一，其发病率已居女性各种恶性肿瘤前列^[1]。而目前乳腺癌主要还是靠自我检查、临床体检、B超及钼靶摄像等经典方法，尚缺乏理想的特异性生物学标志物用于乳腺癌的早期诊断。为此，本研究利用表面增强激光解析离子化飞行时间质谱仪(Surface-enhanced laser desorption-ionization time-of-flight mass spectrometry, SELDI-TOF-MS)及其配套蛋白质芯片筛选乳腺癌生物学标记物，以探讨血清蛋白指纹图谱在乳腺癌早期诊断中的意义。

1  资料与方法

1.1  研究对象

选取2006年9月至2007年4月期间普外科收治的乳腺癌30例，全部经手术及病理证实。年龄35～61岁，平均47.5岁，Ⅰ期4例，Ⅱ期8例，Ⅲa期17例,Ⅲb期2例，Ⅳ期7例,因未手术不能分期的2例。乳腺纤维腺瘤30例经手术及病理证实，另选取正常人30例，均来自健康志愿者。

1.2  主要试验材料与设备

高效液相极水(HPLC)购自Fluka公司；醋酸钠1 mol/L、HCl、磷酸缓冲液(PBS Buffer，10X)、尿素、3-[3-(胆酰胺丙基)二甲氨基]丙磺酸内盐 (CHAPS）、介质酸（SPA）、乙腈、三氟乙酸、Tris盐酸和氢氧化钠均购自于Sigma公司、质控芯片all in one peptide、all in one protein各一根、蛋白质芯片（CM10）、表面增强激光解吸电离飞行时间质谱仪(SELDI-TOF-MS ，PBS-Ⅱ/C型）（均美国Ciphergen公司)等。

1.3  方法

1.3.1  标本的制备  每位研究对象均于清晨抽5 ml空腹血（不抗凝）置冰箱4^oC保存，半小时后取出，4^oC 1 000 r/min半径1.5 cm（下同）离心30 min，吸取血清，按每管100 ml分装。

1.3.2  制备蛋白质芯片  每个芯片放7个样本和1个混合血清，所有样本均用Excel中的RAND表随机排列；另将质控芯片all in one peptide和 all in one protein用标准血清独立做1根芯片,每个芯片上加入1个空白对照(以去离子水代替标本)。取样本，冰上融解（0.5～1 h），4^oC 10 000 r/min离心2 min。取96孔细胞培养板，放冰上，用10 ml枪在每孔上加10 ml U9，每孔分别再加入5 ml血清（直接用力打出，贴壁，不碰壁，不吹吸），放入低温振荡盒4^oC 600 r/min震荡30 min。在样本处理还剩15 min时处理芯片：记下芯片号，用排枪加200 ml 50 mmol/L pH4.0醋酸钠,在低温振荡盒中600 r/min震荡5 min，拍干，重复1次。将96孔板放冰上，用排枪加入185 ml醋酸钠（垂直用力打出，不碰底，不吹吸），低温振荡盒中600r/min震荡2 min左右混匀。用排枪加100 ml处理好的样本到芯片上，快速加入，并用手轻拍加样板去除气泡，若还有气泡，用枪头吹吸。低温振荡盒4^oC 600 r/min震荡1 h，甩掉多余的液体，用力拍干。加200 ml 醋酸钠低温振荡盒常温下600r/min震荡5 min，共进行3次，甩掉，有力拍干。快速加入HPLC 200 ml，甩掉，有力拍干，重复1次。干后加入50%饱和SPA 1 ml,5 min后再点1 ml。

1.3.3  数据的收集  将制备好的蛋白质芯片用SELDI-TOF-MS检测，用Proteinchip 3.0软件自动采集血清蛋白指纹图谱。

1.4  统计学处理和模型建立

用Biomaker Wizard 3.1软件和SPSS 11.5对乳腺癌患者、乳腺纤维腺瘤患者和正常人血清差异蛋白质峰数据作比较和并行方差分析，筛选出差异有统计学意义的蛋白质峰。检验水准α＝0.05。结合各个峰的权重，比较不同蛋白质峰排列组合的判别分析结果，选出最佳组合，建立乳腺癌的蛋白指纹图谱诊断模型。

2  结 果

2.1  差异蛋白质峰的筛选结果

乳腺癌患者、乳腺纤维腺瘤患者和健康人共80份血清样本分别制作为蛋白质芯片，经SELDI-TOF-MS检测后，初步筛选得到有统计学意义的蛋白质峰246个。典型蛋白质峰结果见图1。

图1 典型乳腺癌差异蛋白质峰表现

这些差异蛋白质峰主要集中表现为4个质荷比（m/z）分别为5 700 Da、8 900 Da、5 910 Da和3 933 Da的蛋白质，这4个差异蛋白质峰在乳腺癌患者均出现高表达，其出现频次见表1。在30例乳腺纤维瘤患者和30例正常人中均未发现差异蛋白质峰表达。

表1  差异蛋白质峰的筛选结果

从表1中我们发现m/z 为5700 Da、8900 Da和5910 Da蛋白质在乳腺癌患者中有明显的高表达，而在乳腺纤维和正常人则无明显增高，经检验具有统计学差异（P<0.05）（结果见表2）：

表2  3种差异蛋白质峰在不同研究对象的比较结果（±s）

5 700 Da、8 900 Da和5 910 Da在3组中，*组分别与＃组和△组比较，P值均小于0.05，而＃组与△组比较P大于0.05

2.2  乳腺癌诊断模型的建立

筛选m/z分别为5 700Da、8 900 Da和5 910 Da的 3个蛋白质峰组合建立乳腺癌诊断模型。只要出现这3个蛋白质峰中1个及以上的判断为阳性，定性诊断为乳腺癌；反之则为阴性，不能确定为乳腺癌。

2.4  用盲法对诊断模型的评价结果

用盲法验证该诊断模型对乳腺癌诊断的敏感性和特异性。将该诊断模型对30例乳腺癌患者、30例溃疡病患者进行盲法诊断。结果显示，60例血清标本中，存在1个及以上差异蛋白质峰表达的26例，没有差异蛋白质峰表达的34例，见表3。用该诊断模型筛选乳腺癌，灵敏度为86.7％（26/30），特异度为96.7％（29/30）。

表3 蛋白指纹图谱对乳腺癌和非乳腺癌的检测结果

3  讨 论

近年出现的表面增强激光解析离子化飞行时间质谱（SELDI-TOF-MS）技术是一种新的蛋白质组学研究方法，从整体上全面、动态、定量的分析，比较正常及病变标本中蛋白质种类和数量的改变，捕获与疾病有关的蛋白质，获得尽可能多的蛋白质组学信息，筛选能够用于肿瘤早期诊断、治疗和预后的特异性标志物，具有良好的应用前景^[2,3,4]。美国国立肿瘤研究所组织的早期疾病探测研究机构（EDRN）多中心（6大机构）3期临床实验得出结论：通过血清及仪器标准化质控，SELDI-TOF-MS是目前最有希望的肿瘤早期检测方法^[5]。据国、内外对多种肿瘤血清及尿液检测结果统计，该检测敏感性和诊断特异性均为80％～90％，明显高于传统肿瘤标志物的检测方法。Adam 等^[6]应用SELDI-TOF-MS发现了前列腺癌患者特异性蛋白指纹图谱，敏感性为83％，特异性达到97％，明显优于前列腺特异性抗原（PSA），并且该特异性蛋白指纹图谱可在PSA出现升高的5年前出现。在国内，张建中^[7]、陈军周^[8]、高春芳^[9]和徐文鸿^[10]等利用该技术检测了肝癌、胆管恶性肿瘤、结直肠癌患者相关的差异蛋白质峰表达并建立了相应的诊断模型。笔者^[11]也利用该技术检测了40例胃癌患者，筛选出3个蛋白质峰，m/z分别为4 095 Da、5 910 Da和8 691 Da，这3个蛋白质峰在乳腺癌中均出现明显的高表达，将其作为胃癌诊断模型，用于胃癌诊断敏感性92.5％，特异性97.5％，明显优于CEA、CA199、CA242等血清学标志物。

乳腺癌的临床诊断主要还是依靠体检、钼靶摄像灯检查，虽然也有一些血清学标志物，如CA15.3、CA27.29，但因其敏感性特异性较差，临床很难开展^[12]。而SELDI-TOF-MS为乳腺癌的诊断提供了新的方法。

本研究应用蛋白指纹图谱技术检测了30例乳腺癌患者、30例乳腺纤维腺瘤患者及30例正常人的血清，筛选出3个蛋白质峰，m/z分别为5 700Da、8 900 Da和5 910 Da，这3个蛋白质峰在乳腺癌中均出现明显的高表达。将这3个差异蛋白质峰组合建立乳腺癌的诊断模型，用该模型对30例乳腺癌患者、30例乳腺纤维腺瘤患者和正常人进行盲法诊断，判断其敏感性和特异性，结果灵敏度为86.7％（26/30），特异度为96.7％（29/30），明显优于CA15.3、CA27.29等血清学标志物。因此，这 3个蛋白质峰作为乳腺癌的血清学定性诊断可能有一定的临床应用价值，筛选出来的差异蛋白质可能成为乳腺癌的新的血清学标志物。

本研究因为早期乳腺癌患者入选数量偏少，m/z分别为5 700Da、8 900 Da和5 910 Da的这三个差异蛋白质峰是否在不同的分期有不同的表达尚不能确定，增加Ⅰ期病例数，可能更有利于客观的评价其临床应用价值。

参  考  文  献

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