杨晓玲¹ 时欣欣² 曹军¹ 李桂忠¹

(1 宁夏医科大学病理生理学教研室 银川 750004, 2 河南省洛阳市第三人民医院病理科 洛阳 471002)

【摘要】 目的 观察不同浓度氧化苦参碱对血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)诱导的血管平滑肌细胞(VSMC)增殖过程中基质金属蛋白酶(MMP)9的变化及对细胞增殖影响。方法 分离血管平滑肌细胞,用氧化苦参碱预处理后,用AngII诱导VSMC增殖模型,XTT测定细胞增殖活性,提取VSMC的总RNA和总蛋白,检测MMP9在基因和蛋白水平的表达。结果 与对照组比较,AngⅡ组细胞增殖活性显著增高,不同剂量的氧化苦参碱组的细胞增殖活性明显降低(P<0.01),MMP9的表达亦均明显低于AngⅡ组(P<0.01),且存在剂量依赖关系。结论 氧化苦参碱能够抑制由AngⅡ诱导的VSMC增殖,并能减少MMP9的表达,可能是其抗动脉粥样硬化的机制之一。

【关键词】氧化苦参碱;血管平滑肌细胞;基质金属蛋白酶9;动脉粥样硬化

【中图分类号】R543  【文献标识码】A

The experimental study on the related mechanism of oxymattin on anti-atherosis

Yang Xiaoling¹,Shi Xinxin², Cao Jun¹, Li Guizhong¹

(1. Department of Pathophysiology of Ningxia Medical University, Yinchuan 750004,

2. Laboratory of Infection and Immunity, West China Center of Medical sciences, Sichuan University, Chengdu 610041)

Abstract Objective: To investigate the effect on vascular smooth muscle cells(VSMC) with different concention oxymattine in proliferation and expression of matrix metalloproteinases 9(MMP9) induced by AngII. Methods: Proliferating model of VSMC induced by Ang II was established. Cell proliferating activity was detected by XTT and expression of MMP9 was detected by extraction of total RNA and protein in VSMC. Results: Cell proliferation activity was higher in AngⅡ group than that in control group(P<0.01), while cell proliferation activity was lower in different dose groups of oxymattine. Expression of MMP9 was lower in oxymattine group than in AngⅡ group with dose-dependent manner(P<0.01). Conclusion: The Ang II-induced VSMC proliferation was inhibited and expression of MMP9 was decreased by oxymattine, which may be one of a mechanism of oxymattine against atherosclerosis.

Key words:Oxymattine; Vascular smooth muscle cell; Matrix metalloproteinases 9;   Atherosclerosis

动脉粥样硬化(atherosclerosis,AS)是指动脉内膜脂质、血液成分的沉积,平滑肌细胞及胶原纤维增生,伴有坏死及钙化等不同程度病变的一类慢性进行性病理过程,是心脑血管系统中最常见的疾病之一,严重危害人类健康。近年来,AS在我国亦有明显增加的趋势。血管平滑肌细胞(vascular smooth muscle cells,VSMCs)是AS形成过程中最为重要的细胞之一^[1]。其由中膜向内膜下迁移并异常增殖是AS发生的病理基础,在AS的病理形成过程中具有重要作用。本实验通过原代培养VSMC,经AngⅡ刺激建立VSMC增殖模型,用氧化苦参碱干预,观察氧化苦参碱对血管平滑肌细胞增殖及MMP9 表达的影响,探讨氧化苦参碱抗动脉粥样硬化的相关机制。

作者简介：杨晓玲，1975~，女，硕士，讲师

研究方向：心血管病生

1  材料与方法

1.1 动物及试剂

雄性健康SD大鼠(体重为120～150 g)。胰蛋白酶(Sigma);AngⅡ(Merck公司);博尔泰利注射液(上海绿谷生物);DMEM培养基(Gibco);胎牛血清(杭州四季青),β-actin和MMP9抗体(武汉博士德);RNA提取试剂盒(上海朗顿生物科技有限公司),其它试剂为分析纯产品。

1.2 VSMC培养与鉴定

参照文献^[2]组织块贴壁法培养大鼠VSMCs,培养液为含10％(v/v)胎牛血清的DMEM,光镜以及倒置相差显微镜下观察细胞呈梭形及典型的“峰谷”状生长,α-actin免疫细胞化学染色进行VSMC鉴定,细胞阳性率在95％以上。

1.3 分组

选择5-8 代VSMC进行实验。实验分组:①空白对照组:仅给予无血清的DMEM培养;②AngⅡ组(阴性对照组):加入终浓度为10^-7mol/L的 AngⅡ培养;③氧化苦参碱低剂量组:加入终浓度为10^-5mol/L氧化苦参碱孵育12h后再加AngⅡ培养;④氧化苦参碱高剂量组:加入终浓度为10^-4mol/L氧化苦参碱孵育12h后再加AngⅡ培养,进行下述指标的测定。

1.4 XTT法检测细胞增殖活性  

将VSMC按照1×10⁴个/孔浓度接种于96孔培养板,分组同上,每组6孔。在加入AngⅡ后继续培养24h,每孔加入40μL XTT/PMS(1mg/mL)混合液, 4h 后收集培养液上清,用酶标仪测定490 nm波长处吸光度, 计算平均抑制率。抑制率= (A阴性对照– A实验) / A 阴性对照×100 %。实验重复三次。

1.5 RT-PCR法检测细胞内MMP9 mRNA水平 

将VSMC按照1×10⁶个/孔浓度接种于6孔培养板,实验结束后收集各组细胞,按照总RNA提取试剂盒说明书提取总RNA,紫外分光光度计测定浓度,各组OD260/OD280均在1.8-2.0左右。定量后,分别加入适量的RNA,按照Quant Reverse Transcriptase逆转录说明书合成第一链cDNA。根据大鼠MMP9 和β-actin cDNA全长序列设计引物。MMP9基因引物序列为:Sense链:5’- ACCGCTATGGTTACACTCG -’3,anti-sense链:5’- GTGGGCATCTCCCTGAAT -’3,产物长度为461bp; β-actin引物序列为:Sense链:5’- GAGGGAAATCGTGCGTGAC -’3,anti-sense链:5’- CCTGGGTACATGGTGGTG -’3,产物长为309bp。以合成的cDNA为模板进行PCR,反应体系50μL,条件为:94℃预变性2min,94℃变性30s,退火温度55℃30s,72℃延伸45s,35个循环,72℃延伸10min。PCR产物于1.5%琼脂糖凝胶电泳,凝胶系统成像作半定量分析,MMP9 mRNA相对表达量以同一体系中目的基因产物电泳条带密度指数与内参照β-actin电泳条带密度指数的比值来表示。

1.6 Western-boltting法检测VSMC中MMP9 蛋白水平

收集6孔板中的细胞,4℃细胞裂解液裂解细胞后,按照蛋白提取试剂盒说明步骤提取VSMC的总蛋白,BCA法测量蛋白后调节上样蛋白量,进行聚丙烯酰胺凝胶电泳,按半干转法将电泳产物转移到PVDF膜, 5%脱脂奶粉37℃封闭2h,加入一抗(1:500),4℃过夜, 再加入二抗(HRP-山羊抗小鼠IgG, 1:3 000) 37 ℃孵育1.5h,按ECL试剂盒说明进行显色。

1.6 统计学处理

所获资料用SPSS13. 0 统计学软件进行方差分析,结果以x ±s 表示,当P < 0.05 时为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 氧化苦参碱抑制VSMC细胞增殖

与空白对照组相比,AngⅡ组细胞增殖活性明显增高 (P<0.01);与AngⅡ组比较,随着氧化苦参碱浓度的增加,VSMC的增殖活性逐渐降低,即氧化苦参碱对VSMC的增殖抑制作用呈剂量依赖性,见图1。说明氧化苦参碱能够抑制AngⅡ诱导的VSMC增殖效应。

表1 氧化苦参碱对VSMC的增殖抑制作用(x ±s,n = 6)

* P < 0. 05 vs 空白对照组,# P < 0. 05 vs AngⅡ组

2.2 氧化苦参碱抑制MMP9基因的mRNA表达

将RT-PCR扩增产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳,可见461bp和309bp的目的条带,分别是MMP9基因和β-actin基因,见图1。应用凝胶成像分析系统扫描半定量分析1-4泳道的灰度值(IVD),计算各个样本的MMP9/β-actin值,即为MMP9 mRNA的相对含量,见图2。VSMC经AngⅡ刺激后,MMP9 mRNA的相对含量显著高于空白对照组(P<0.01),而经氧化苦参碱预处理VSMC 12h,再用AngⅡ刺激,MMP9 mRNA的表达较AngⅡ组明显降低,差异有显著性(P<0.01),且随着氧化苦参碱剂量的增加MMP9 mRNA的表达量逐渐减少见图2。

1,空白对照组;2,AngⅡ组;3,氧化苦参碱低剂量组;4,氧化苦参碱高剂量组

图1 VSMC中MMP9 mRNA 表达的变化

* P < 0. 05 vs 空白对照组,# P < 0. 05 vs AngⅡ组

图2 VSMC MMP9/β-actin灰度值比较

2.3 氧化苦参碱抑制MMP9的蛋白表达

VSMC经AngⅡ刺激后,MMP9 蛋白表达量显著高于空白对照组(P<0.01),而经氧化苦参碱预处理VSMC 12h,再用AngⅡ刺激,MMP9 蛋白表达量较AngⅡ组明显降低,差异有显著性(P<0.01),且以高浓度氧化苦参碱剂量组降低最为显著(P<0.01) ,说明氧化苦参碱能够以浓度依赖的方式抑制VSMC MMP9的表达。见图3、图4。

1,空白对照组;2,AngⅡ组;3,氧化苦参碱低剂量组;4,氧化苦参碱高剂量组

图3 VSMC中MMP9 蛋白表达的变化

* P < 0. 05 vs 空白对照组,# P < 0. 05 vs AngⅡ组

图4 VSMC MMP9/β-actin灰度值比较

3 讨论　　

氧化苦参碱为苦参类生物碱之一,是从豆科植物苦参、广豆根中提取的生物碱,具有四环喹嗪啶类结构,可抑制肝星状细胞、肿瘤细胞的增殖、稳定红细胞和溶酶体膜、减少炎症介质的释放,有抗纤维化和延缓肿瘤进展的作用^[3-5]。近年发现,苦参总碱能扩张冠状动脉,增加冠状动脉血流量,显著降低大鼠实验性高脂血症的血清甘油三酯、升高HDL水平,降低血黏度,减少小鼠腹腔巨噬细胞分泌IL-1,有效的清除氧自由基等作用。因此,氧化苦参碱具有调节免疫、防止纤维化和心血管保护^[6,7]等多种药理活性和临床功能,是一种极具开发潜力的药用生物碱。

研究表明^[8],血管平肌细胞的增殖和表型转化在心血管系统疾病的发生发展中起重要作用,是高血压、动脉粥样硬化等心血管疾病的共同细胞病理基础之一。血管平滑肌细胞在各种细胞外信息分子作用下,经过细胞内信号转导系统到达核内,诱导一系列与VSMC增殖相关基因活化、蛋白质合成,最终导致VSMC增殖^[9]。AngⅡ可以通过与VSMC表面的AngⅡ受体结合,激活细胞内的信号转导和细胞核内基因转录的活化,诱发VSMC增殖^[10]。本实验结果显示,AngⅡ能显著增加VSMC增殖活性,说明AngⅡ能促进培养的VSMC增殖,与文献报道一致^[11]。氧化苦参碱预处理VSMC后,再用AngⅡ刺激,VSMC的增殖效应明显减弱,提示氧化苦参碱可以抑制AngⅡ诱导的VSMC增殖,并且呈剂量依赖性。

MMPs 是一类含有锌离子、结构高度同源的内肽酶的总称, MMPs 降解基质削弱病变血管内皮细胞的屏障功能,使中层 SMCs 早期迁移、增殖,促进循环炎性细胞的浸润, 加重血管结构改变。VSMCs 在受到细胞因子刺激时可以表达和激活MMPs^[12,13],其分泌的MMP-2和MMP-9可有效降解包绕在平滑肌细胞外的基底膜,促进中层SMC侵袭和迁移至内膜,从而促进AS斑块的形成^[14]。因此,减少细胞外基质的降解(抑制MMPs活性)和减轻血管平滑肌细胞增殖迁移的程度能延缓AS的进展。本实验结果显示,AngⅡ组VSMC的MMP9的表达在基因水平和蛋白水平均显著高于空白组,而用不同浓度的氧化苦参碱预处理后,VSMC内的MMP9的mRNA和蛋白表达均显著降低,且以高浓度组更为明显。提示氧化苦参碱可从基因水平和蛋白水平抑制VSMC内MMP9表达。综上所述,氧化苦参碱能减弱AngII对VSMC的促增殖作用,并能抑制其MMP9的表达,这可能是氧化苦参碱抗动脉粥样硬化的机制之一。但氧化苦参碱通过何种机制抑制VSMC的增殖及其MMP9的表达尚不清楚,其可能的信号通路是什么,如何进行调控的,需进一步的研究和探讨。

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