章红星  金建平

（芜湖市食品药品检验所，安徽 芜湖 241000）

摘要：目的 建立杞菊地黄丸的微生物限度检查方法。方法 按照《中国药典》2005 年版一部微生物限度检查方法中的平皿法对样品进行微生物限度验证试验。结果 5 株阳性菌的回收率均可达到70％以上。结论 可按平皿法对杞菊地黄丸进行微生物限度检查。

关键词：杞菊地黄丸；微生物限度检查；平皿法

To Establish a Method for Microbial Limit Test of Qiju Dihuang Wan

Zhang Hong-xing, Jin Jian-ping

(Wuhu Institute for Drug Control, Anhui Wuhu 241000)

Abstract: Aim To establish a method for microbial limit test of Qiju Dihuang Wan. Methods The validation test for microbial limit examination of Qiju Dihuang Wan was according to the method of Chinese Pharmacopoeia. Results The recovery is over 70% in 5 positive strains by the method of culture dish.Conclusion The validation method of Qiju Dihuang Wan for microbial limit should use culture dish method.

Key words: Qiju Dihuang Wan; microbial limit test ; method of culture dish

杞菊地黄丸（浓缩丸）为滋肾养肝的中成药，主要用于肝肾阴亏的眩晕、耳鸣、目涩畏光、视物昏花。该品种微生物限度的检查包括染菌量及控制菌的检查，是评价生产单位所用的药用原辅料、设备、器具、工艺流程、生产环境和操作者卫生状况的重要手段和依据^[1]。《中国药典》2005 年版一部要求“ 当建立药品的微生物限度检查时，应进行方法学验证，以确定所采用的方法是否适合于该药品的微生物限度检查^[2]。本试验采用平皿法对杞菊地黄丸（浓缩丸） 进行微生物限度检查验证试验，并且测定5 株阳性菌的回收率，确认所采用的细菌、霉菌和酵母菌计数方法和控制菌检查方法是否适合于该品种的微生物限度检查。

1 试验材料

1.1  样品 杞菊地黄丸（浓缩丸）芜湖绿叶制药有限公司提供，批号：100155。

1.2  验证用菌株 大肠埃希菌[CMCC(B) 44 102] 第2代、金黄色葡萄球菌[CMCC(B) 26 003] 第2代、枯草芽孢杆菌[CMCC(B) 63 501] 第2代、白色念珠菌[CMCC(F) 98 001] 第2代、黑曲霉[CMCC(F) 98 003] 第2代。以上菌种均购自中国药品生物制品检定所。

1.3  培养基 胆盐乳糖培养基，批号：080527；乳糖胆盐发酵培养基，批号：090105；玫瑰红钠琼脂培养基，批号：080313；营养琼脂培养基，批号：080519；营养肉汤培养基，批号：090226；改良马丁培养基080414。以上培养基均购自中国药品生物制品检定所。

1.4  其他 pH7.0氯化钠-蛋白胨缓冲液 ，批号：090205，购自中国药品生物制品检定所；中国细菌浊度标准（标准比浊管），批号：2009-1，购自中国药品生物制品检定所；0.9%氯化钠溶液，批号：090815 1R，安徽双鹤药业有限责任公司提供。

2  试验方法

按《中国药典》2005年版一部附录微生物限度检查方法验证试验，验证试验进行3次独立的平行试验，并分别计算各试验菌的回收率。

2.1  细菌、霉菌及酵母菌计数

2.1.1 供试液制备 取杞菊地黄丸（浓缩丸）10g，加pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液100ml，用匀浆仪粉碎, 混匀, 作为1：10的供试液，再用上述稀释液稀释按10倍递增成1：10²稀释级，备用。

2.1.2 菌液的制备 取经35℃培养24h的大肠埃希菌和金黄色葡萄球菌的肉汤培养物1ml+9ml的0.9%无菌氯化钠溶液，10倍稀释至10^-5～10^-7为50～100cfu/ml的菌悬液，做活菌计数，备用；取经35℃培养7d的枯草芽孢杆菌的肉汤培养物1ml+9ml的0.9%无菌氯化钠溶液，10倍稀释至10^-5～10^-7为50～100cfu/ml的菌悬液，做活菌计数，备用；取经25℃培养3d的白色念珠菌的马丁培养物1ml+9ml的0.9%无菌氯化钠溶液，10倍稀释至10^-5～10^-7为50～100cfu/ml的菌悬液，做活菌计数，备用；取经25℃培养7d的黑曲霉斜面培养物，加水5ml，洗下霉菌孢子，用带有棉花的球形吸管取出菌液，用标准比浊管比浊后，用0.9%无菌氯化钠溶液稀释至为50～100cfu/ml的菌悬液，做活菌计数，备用。

3  细菌、霉菌和酵母菌平皿法计数验证

3.1 试验组 分别取试验用的1：10、1：10²供试液1ml和1ml含50～100cfu/ml试验菌（大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌）的菌悬液，分别注入平皿中，立即倾注45℃^[3]营养琼脂培养基， 35℃，48小时培养；分别取试验用的1：10、1：10²供试液1ml和1ml含50～100cfu/ml试验菌（白色念珠菌、黑曲霉）的菌悬液，分别注入平皿中，立即倾注45℃玫瑰红钠琼脂培养基， 25℃，72小时培养。每株试验菌平行制备2个平皿，观察并记录菌落数，菌落计数见表1。

3.2 菌液组 取1ml含50～100cfu/ml试验菌（大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、白色念珠菌、黑曲霉）的菌悬液，分别注入平皿中，立即倾注45℃琼脂培养基，其中大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌倾注营养琼脂培养基，35℃，48小时培养；白色念珠菌、黑曲霉倾注玫瑰红钠琼脂培养基，25℃，72小时培养。每株试验菌平行制备2个平皿，测定所加试验菌数，观察并记录菌落数，菌落计数见表2。

3.3 供试品对照组 取规定量供试液测定供试品本底菌数。取1：10、1：10²杞菊地黄丸（浓缩丸）供试液1ml，加入平皿中，立即倾注45℃营养琼脂培养基，35℃培养48小时；取1：10、1：10²杞菊地黄丸（浓缩丸）供试液1ml，加入平皿中，立即倾注45℃玫瑰红钠琼脂培养基，25℃培养72小时，每个稀释级供试液平行制备2个平皿，观察并记录结果。菌落计数见表3。

 试验组菌的回收率见表4。

         回收率=×100%

3.4 稀释剂对照组 取试验用的pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液1ml和1ml含50～100cfu/ml试验菌（大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、白色念珠菌、黑曲霉）的菌悬液，分别注入平皿中，立即倾注45℃琼脂培养基，其中大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌倾注营养琼脂培养基，35℃，48小时培养；白色念珠菌、黑曲霉倾注玫瑰红钠琼脂培养基，25℃，72小时培养。每株试验菌平行制备2个平皿，观察并记录菌落数，菌落计数见表5。

稀释剂对照组菌的回收率见表6。

 回收率=×100%

4  控制菌验证

4.1大肠埃希菌验证

验证大肠埃希菌用金黄色葡萄球菌作为阴性对照菌。

(1) 阳性组 取1ml含菌量为10～100cfu/ml的大肠埃希菌对照菌液加入到100ml胆盐乳糖增菌液中，于35℃培养24小时。

(2) 供试液组 取10ml 1：10的杞菊地黄丸（浓缩丸）供试液加入到100ml胆盐乳糖增菌液中，于35℃培养24小时。

(3) 供试液+阳性菌  取含菌量为10～100cfu/ml l的大肠埃希菌对照菌液1ml和10ml的供试液加入到100ml胆盐乳糖增菌液中，于35℃培养24小时。

(4) 供试液+阴性菌  取含菌量为10～100cfu/ml的金黄色葡萄球菌对照菌液1ml和10ml的供试液加入到100ml胆盐乳糖增菌液中，于35℃培养24小时。

取上述各组培养物0.2ml，接种至含5ml MUG培养基的试管内培养，于5小时、24小时在366nm紫外线下观察，同时用未接种的MUG培养基作本底对照，观察后，沿培养管的管壁加入数滴靛基质试液观察。结果见表7。

注：（+）表示呈阳性反应、（-）表示呈阴性反应。

4.2 大肠菌群验证

验证大肠菌群用大肠埃希菌作为阳性对照菌。

(1) 阳性组 取1ml含菌量为10～100cfu/ml的大肠埃希菌对照菌液加入到10ml乳糖胆盐发酵管中，于35℃培养24小时。

(2) 供试液组 取1ml 1：10的杞菊地黄丸（浓缩丸）供试液加入到10ml乳糖胆盐发酵管中，于35℃培养24小时。

(3) 供试液+阳性菌  取含菌量为10～100cfu/ml的大肠埃希菌对照菌液1ml和1ml 1：10的供试液加入到10ml乳糖胆盐发酵管中，于35℃培养24小时。

培养结果见表8。

注：（+）表示呈阳性反应即产酸产气、（-）表示呈阴性反应即不产酸产气。

5 讨论

5.1 杞菊地黄丸（浓缩丸）的主要成分^[4]为枸杞子、菊花、三茱萸、牡丹皮、山药、茯苓、泽泻。这些中药具有一定的清热、解毒及消炎的作用，但抑菌作用都比较弱。实验表明：杞菊地黄丸（浓缩丸）对5种阳性菌的平皿法回收率均高于70%；控制菌验证的“供试液+阳性菌”组阳性菌生长良好，因此，可以确定杞菊地黄丸（浓缩丸）微生物限度检查法中，其细菌、霉菌和酵母菌数测定为平皿法；大肠埃希菌及大肠菌群的测定按常规法进行。

5.2 菌落计数方法验证中, 大肠埃希菌代表革兰阴性杆菌, 金黄色葡萄球菌代表革兰阳性球菌, 枯草芽孢杆菌代表芽孢杆菌，而枯草芽孢杆菌是需氧芽孢杆菌属, 其生活周期包括了繁殖期、胞子囊期和芽孢期, 芽孢是其赖以长期存活的主要形式，有文献^{[5] [6] [7]}报道对2种菌悬液的稳定性进行考察，在4℃环境中, 菌体在菌悬液中易代谢老化而死亡，放置1周死亡率达80%，培养7d d的芽孢悬液, 在4～8℃下可保存6～12个月。

对其2种菌悬液进行染色、镜检。结果表明：接种枯草芽孢杆菌的新鲜培养物至营养肉汤培养基中，培养24 h，菌体菌悬液芽孢含量少，绝大多数是不带芽孢的杆菌；接种枯草芽孢杆菌的新鲜培养物至营养琼脂斜面, 经培养7d, 用灭菌水冲洗菌苔制成菌悬液，65℃水浴30 min，芽孢菌悬液芽孢含量达到85%以上。所以以芽孢菌悬液作为药品微生物验证用菌液,笔者认为更为科学合理, 且能提高工作效率, 节约成本。

参考文献

[1] 中国药品生物制品检定所. 中国药品检验标准操作规范[S].北京：中国医药科技出版社，2005 ：325.

[2] 国家药典委员会. 中国药典（一部）[S].北京：化学工业出版社，2005 ：附录70-79.

[3] 杨 静. 药品微生物限度检查法的影响因素分析[J].中国药事，2008，22（12）：1095.

[4] 卫生部药品标准. 中药成方制剂第八册[S].1993 ：77.

[5] 张治锬. 抗生素药品检验[S].北京：人民卫生出版社，1991：29.

[6] 由亚宁，任安民，裴为芝. 药品微生物验证枯草芽孢杆菌实验菌液制备方法的探讨[J]. 西北药学杂志， 2007，22(6) ：345.

[7] 温玉莹，李　汶，陈之敏. 微生物验证试验中枯草芽孢杆菌菌悬液制备的探讨[J]. 今日药学，2009，19（5）：69-70.