肾活检病理标本的制作方法

所属分类：医学论文  日期：2018-09-17  浏览：次

 

高宝红（山西省中医院  病理科   030012）

关健词：肾活检穿刺  固定  特殊染色  免疫荧光法

肾穿刺活体组织病理学检查简称肾活检病理检查，是肾脏病学的一个重要组成部分。肾活检的病理诊断，已经形成了肾内科临床医生对肾脏病患者进行诊断、治疗和判断预后的一个重要参考依据。其中肾活检病理检查的免疫荧光制片技术，特殊染色技术，HE染色技术与肾活检的病理诊断的正确与否有着密切的关系。本文主要介绍：肾活检组织的光镜及免疫荧光切片制作与染色。

一  . 光镜切片的制作与染色

（一）光镜切片的制作：包括固定、脱水、透明、浸蜡、包埋、切片和染色等步骤，程序

1.固定：将供光镜检查的肾刺穿组织尽快浸入AF液中24小时。（AF液：每100毫升AF液中含10%福尔马林15毫升96%乙醇85毫升）

2.脱水：梯度乙醇脱水：70%乙醇10分钟→80%乙醇10分钟→90%乙醇10分钟→95%乙醇I10分钟→95%乙醇II10分钟→100%乙醇I10分钟→100%乙醇II10分钟

3.透明：入二甲苯I10分钟→二甲苯II10分钟

4.浸蜡：入石蜡I10分钟→石蜡II10分钟→石蜡III10分钟【石蜡温度在65-75℃】

5.包埋：将彻底浸蜡的组织用石蜡包埋成规整的方形块状物体，便于在切片机上切片。

6.切片：厚度2um。

二  .  染色：

（一） HE染色：

1.脱蜡：石蜡切片入二甲苯脱蜡（该液为纯液，共脱三缸，每缸浸泡10分钟）

2.梯度乙醇：从无水乙醇→96%乙醇→80%乙醇→70%乙醇。

3.自来水冲洗。

4.入苏水素液30分钟。

5.自来水冲洗。

6.1%盐酸酒精（配制在普通玻璃缸）分化。

7.1%氨水（配制在普通玻璃缸）还原。

8.自来水冲洗。

9.1%伊红：1分钟

10.自来水冲洗。

11.梯度乙醇脱水：70%乙醇→80%乙醇→96％乙醇→无水乙醇。

12.二甲苯透明。

13.中性树脂封片。

（二） PAS染色：

1.石蜡切片二甲苯脱蜡

2.梯度入乙醇：从无水乙醇→96%乙醇→80％乙醇→70％乙醇。

3.自来水冲洗。

4.1%过碘酸：氧化10分钟。

5.自来水冲洗。

6.将玻片置虑纸上干燥，然后滴加雪夫氏液，使染液覆盖全部组织，待组织变红即可。

7.切片插入塑料染色架，入塑料染色缸内，自来水流水冲洗10分钟。

8.入苏木素（配制在塑料染缸中）10分钟。

9.自来水冲洗。

10.1%盐酸酒精（配制在普通玻璃缸）分化。

11.1%氨水（配制在普通玻璃缸）还原。

12.自来水冲洗。

13.梯度乙醇脱水：70%乙醇→80乙醇→96％乙醇→无水乙醇。

14.入二甲苯透明。

15.中性树胶封片。

（三） PASM染色：

1.石蜡切片入二甲苯脱蜡。

2.梯度乙醇进水：从无水乙醇→96%乙醇→80%乙醇→70%乙醇。

3.自来水冲洗。

4.1%过碘酸（倒入小卧式玻璃染缸中）氧化10分钟。

5.自来水冲洗。

6.银染液（配制在小的玻璃缸中）

3%乌洛托品80ml

2%硼砂10ml

5%硝酸银10ml配成银染液（应现配现用）放入至少80⁰C烤箱中，显微镜下观察基底膜为深棕色至黑色时取出。

7.自来水冲洗。

8.0.25%氯化金（倒入小卧式玻璃染缸中）浸泡1分钟（浸泡后回收）。

9.自来水冲洗。

10.3%硫代硫酸钠（倒入小卧式玻璃染缸中）还原1分钟（浸泡后回收）。

11.自来水冲洗后插入塑料染色架放入苏木素浸泡10分钟。

12.自来水冲洗。

13.1%盐酸酒精（配制在普通玻璃缸）分化。

14.1%氨水（配制在普通玻璃缸）还原。

15.自来水冲洗。

16.1%伊红（配制在塑料染缸中）染缸浸泡1分钟。

17.自来水冲洗。

18.梯度乙醇脱水：70%乙醇→80%乙醇→96%乙醇→无水乙醇。

19.入二甲苯透明。

20.中性树胶封片。

（四） Masson染色：

1.石蜡切片入二甲苯脱蜡。

2.梯度乙醇脱水：从无水乙醇→96%乙醇→80%乙醇→70%乙醇。

3.自来水冲洗。

4.Bouin氏液固定10分钟。

5.自来水冲洗。

6.媒染液：（10%重铬酸钾和10%三氯醋酸等量混合）倒入小卧式玻璃染缸中浸泡30分钟。

7.自来水冲洗。

8.1%天青石兰（倒入小卧式玻璃染缸中）浸泡10分钟。

9.自来水冲洗。

10.入苏木素10分钟。

11.自来水冲洗。

12.1%盐酸酒精（配制在普通玻璃缸）分化。

13.1%氨水（配制在普通玻璃缸）还原。

14.自来水冲洗。

15.1%丽春红（倒入小卧式玻璃染缸中）浸泡5分钟。

16.酸性水冲洗。

17.1%磷钼酸（倒入小卧式玻璃染缸中）氧化30分钟。

18.酸性水冲洗。

19.1%亮绿（倒入小卧式玻璃染缸中）5分钟。

20.酸性水冲洗。

21.梯度酒精脱水：70%乙醇→80%乙醇→96%乙醇→无水乙醇。

22.入二甲苯透明。

23.中性树胶封片。

三  .  免疫荧光切片的制作：

（一）切片：穿刺肾组织切皮质端一段，放置在生理盐水浸泡过的纱布上，制作成5um的冰冻切片。

（二）直接免疫荧光法

1.冰冻切片温室干燥1小时。

2.PBS缓冲液冲洗3次。

3.滴加荧光素标记的抗体：IgA、IgG、IgM、C3、C4、Ciq、Fib。

4.放入孵育盒内，37⁰C温箱30分钟，取出放置在室温下24小时。

5.PBS缓冲液冲洗3次。

6.甘油封片。

7.荧光显微镜下观察。

（三）（间接免疫荧光法）

1.冰冻切片温室干燥1小时。

2.PBS缓冲液冲洗3次。

3.滴加未标记的抗体（1抗）S、C、κ-chain、λ-chain.。

4.放入孵育盒内，放置在室温下24小时

5.PBS缓冲液冲洗3次。

6.滴加荧光素标记的抗1抗的抗体（2抗），2抗为1抗动物的1Gg ZF—0311、ZF—0312。

7.放入孵育盒内，放置在室温下24小时。

8.PBS缓冲液冲洗3次。

9.甘油封片。

10.荧光显微镜下观察。

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