河北大学医学院 孟洁，段斐，高文,李少春，孙晓芳，程炜，石瑜，刘未华，

【摘要】：目的：观察α玉米赤霉醇（α-ZAL）对体外培养新生大鼠颅骨成骨细胞凋亡的影响。方法：在新生大鼠颅骨成骨细胞体系中加入不同浓度的α玉米赤霉醇,应用流式细胞仪检测细胞的凋亡。结果：α玉米赤（α-ZAL）霉醇能抑制大鼠颅骨成骨细胞凋亡 。结论：α玉米赤霉醇可抑制成骨细胞凋亡。

【关键词】：α玉米赤霉醇；成骨细胞；凋亡

The Study ofα-ZAL Influence onApoptosis of rat osteoblasts

[Abstract]　Objective: To studied α-ZAL influence on apoptosis of human bladder cancer T24 cells.Methods：Rat osteoblasts were cultured.And then,different density ofα-ZAL apoptosis added into above cells and incubated to observe influence on apoptosis；Cell rates were detected by flow cytometer.Results: α-ZAL inhibited Apoptosis of rat osteoblasts. Conclusion: α-ZAL can inhibit the apoptosis of rat osteoblasts in vitro.

[KEY WORDS]　 α-ZAL; Osteoblast; Apoptosis

绝经后骨质疏松（Postmenopausal Osteoporosis, PMOP）是由于卵巢功能衰竭，雌激素下降而引发的中老年妇女的常见病、多发病。雌激素是当前防治绝经后骨质疏松的首选药物，此疗法即为雌激素替代疗法（Hormone replacement treatment.HRT）。但是，长期使用雌激素有诱发乳腺癌、子宫内膜癌和肺栓塞的危险。因此植物雌激素的研究为人类寻觅有效而安全的雌激素依赖性疾病的治疗药物展示了新的前景。其中植物雌激素α玉米赤霉醇（α-Zearalanol,α-ZAL)是的前景很广泛。α-ZAL是玉米赤霉烯酮(Zearalenone,ZEN)的还原产物，ZEN是玉米赤霉菌(Gibberella Zeae)的一种代谢产物。但是α-ZAL的生物效应是ZEN的3倍，而且应用更安全。它具有与雌二醇类似的抗动脉粥样硬化及抑制组织因子分泌等作用，可产生心血管保护效应^[1]，同时对于由切除卵巢及由β淀粉样蛋白所致神经细胞损伤，对模拟阿尔茨海默氏病(AD)模型小鼠均有保护作用，作用与雌二醇相似。本研究将通过对体外成骨细胞的培养来探讨α-ZAL对成骨细胞凋亡的影响。

1材料

1.1 仪器与试剂  倒置显微镜、CO2培养箱（上海力申科学仪器有限公司产）、离心机（北京京立离心机有限公司产）、PBS（北京通宝达生物技术中心产）、胎牛血清（赛默飞世尔生物化学制品（北京）有限公司产）、胰蛋白酶（AMRESCO公司产）、Ⅱ型胶原酶（SIGMA公司产）、注射用青霉素钠，注射用硫酸链霉素（华北制药股份有限公司产）、二甲基亚砜（DMSO）（AMRESCO公司产）、17β雌二醇（SIGMA公司产）、α玉米赤霉醇（DR. ehrenstorfer Gmbh 公司产）。

1.2 动物  SD大鼠（河北医科大学动物中心提供）

2. 方法及结果

2.1 大鼠成骨细胞的分离培养

取一日龄SD大鼠十只，断颈椎处死后，放入75%的酒精中，10分钟，酒精中取出小鼠，从颈部沿头盖骨剥离皮肤，取下头盖骨; 用含双抗的PBS洗涤头盖骨，洗两次;于青霉素小瓶内将头盖骨剪成泥状，加入0.25%胰蛋白酶37℃消化20min后，用PBS洗涤，吹打均匀，沉淀，吸去上清液;加入0.1%胶原酶37℃消化1h后，加细胞培养液，吹打均匀;重复一次，于离心机以1000rpm的速度，离心 15min ,使细胞沉淀，加入含10%胎牛血清的DMEM培养液培养, 24 h后换液,以后隔日换液1次。培养至第4-7天,细胞长成致密单层,铺满培养瓶底,进行传代。传代时,弃去原培养液,用PBS液冲洗,0.25%胰蛋白酶消化,弃去消化液,加入培养液,吹打培养瓶底,使细胞脱落,制成细胞悬液,接种于新的培养瓶,置37℃、5%CO2中静置培养。

2.2 流式细胞术测定 按1×10⁶个/瓶将细胞接种于培养瓶中,待细胞贴壁后, 换上加药培养基（α-ZAL终浓度各为10^-7 mol/L， 10^-10 mol/L，E2组浓度10^-10 mol/L，），继续培养24h后，弃去培养基，用0.25%胰酶消化，弃去胰酶，加入PBS吹打细胞，移入离心管，1500转，离心10分钟，弃去PBS，加入新PBS，再次离心，弃去PBS，加入新PBS1ml，待测。

2.3 统计学处理  实验数据用±S表示，采用统计软件SPSS进行分析。两两比较采用t检验。P＜0.05为有统计学意义。

2.4 实验结果

2.41 正常成骨细胞的形态学观察   在倒置显微镜下观察,成骨细胞呈三角形、纺缍或菱形,胞浆丰富并向外伸展,伸出几个突起与邻近细胞伸出的突起相连。胞核大而清楚,呈圆形或卵圆形,含1-2个核仁。

2.42 流式细胞术结果分析

阳性对照组

α-ZAL10^-7 mol/L

正常组

α-ZAL10^-7 mol/L

由上图可知，α-ZAL10^-7 mol/L和α-ZAL10^-7 mol/L的成骨细胞凋亡率要低于正常组，可知α-ZAL10^-7 mol/L和α-ZAL10^-7 mol/L对成骨细胞的凋亡有抑制作用，可促进成骨细胞增殖。

3.讨论

由于长期应用雌激素治疗绝经后骨质疏松症有诱发乳腺癌、子宫内膜癌和肺栓塞的危险^[2]，因此，医务工作者希望可以找到一种新药，既可以对骨质疏松症能起到雌激素样治疗作用，而其副作用又很小。于是人们将注意力投向植物体内含有的类雌激素样物质(具有动物雌激素某种生理功能的生物活性物质)———植物雌激素的研究上。α-ZAL是天然内源性植物激素玉米赤霉烯酮(zearalenone,ZEN)的还原产物，属于二羟基苯酸内酯类化合物，具有促生长效应，与高等植物的发育有关，广泛存在于豆类、谷物等多种植物中^[3]。α-ZAL结构与雌激素非常近似，在代替雌激素治疗其他疾病中取得了很好的疗效。

现代医学认为骨质疏松症的发生与成骨细胞和破骨细胞的偶联失衡有关。成骨细胞具有合成、分泌组成骨基质胶原和糖蛋白的作用，在维持机体内环境稳定，生理机制调节和骨代谢疾病中发挥主要作用^[4]。成骨细胞是骨形成细胞,是骨形成和代谢的核心部分,对骨组织的生长发育和骨损伤的修复起关键作用^[5]，负责骨基质的合成、分泌和矿化，在骨组织的生长、发育与重建过程中起重要作用。国外有研究认为雌激素调节Fas基因表达在体外外胚乳和在体大鼠骨膜上是一样的,因此可以利用大鼠骨细胞进行体外培养实验^[6]。现代医学认为骨质疏松症的发生与成骨细胞和破骨细胞的偶联失衡有关。成骨细胞具有合成、分泌组成骨基质胶原和糖蛋白的作用，在维持机体内环境稳定，生理机制调节和骨代谢疾病中发挥主要作用。

本实验采用酶消化法法分离新生大鼠颅骨,并培养成骨细胞,该方法方便易行,可分离和培养大量高纯度的大鼠成骨细胞。这些成骨细胞在体外传代后,仍保留了其表型特征,生物学特性改变小,可保证实验用成骨细胞的来源。

     细胞凋亡是细胞受到某些因素的刺激后的一种主动的细胞自主死亡的方式，其形态学表现为细胞体积缩小，细胞核固缩，染色质边聚，胞膜呈泡状突起。流式细胞仪检测的基本原理是主要是根据细胞凋亡时在细胞、亚细胞和分子水平上所发生的特征性改变。这些改变包括细胞核的改变、细胞器的改变、细胞膜成分的改变和细胞形态的改变等，其中细胞核的改变最具特征性，造成各种染色体荧光染料对凋亡细胞DNA可染性降低。在流式细胞仪上，前散射光与细胞的大小有关，而侧散射光反映的是光在细胞内的折射作用，与细胞内的颗粒多少有关。在细胞凋亡时，细胞固缩，体积变小，故前散射光降低，这一特性往往被认为是凋亡细胞的特点之一。此外细胞凋亡时由于染色体降解，核破裂形成，细胞内颗粒往往增多，故凋亡细胞侧散射光常增加^[7]。

    本研究结果显示α-ZAL10^-7 mol/L和α-ZAL10^-7 mol/L对成骨细胞的凋亡有抑制作用。

参考文献

[1] 戴顺龄,段金虹,陆媛等。新的植物雌激素α玉米赤霉醇明显抑制实验性动脉粥样硬化发病进程，中国动脉硬化杂志， 2003，11(5)，385-390 .

[2] 石书芳，俞超芹.植物雌激素及其作用靶点的研究进展[J]，中西医结合学报， 2005，3（5）：408-410

[3] WangW, Zhu GJ. Comparision between phyoestrogen α-zearalanol and supplementary ectogenesis 17β-estradiol in the effect on coagulation and fibrnolysis in ovariectomized rats Chinese Journal of Clinical Reha-bilitation.2005,9(27):195-197.

[4] 刘继平， 程玥. 中药促进成骨细胞功能和ALP活性影响研究的意义 陕西中医学院学报，2010，33(1)：7

[5] 秦腊梅、肖永华、牛福玲等，三仙汤对成骨细胞增殖的影响，中国临床康复，2002,6（7）：992-993.

[6] Zheng Rui-min, LIN Shou-qing, LIU Yong et al. Effect of estrogen on gene expression of fatty acid synthase in periosteum.  Chinese Medical Journal. 2009 ,122(15):1775-1779.

[7] 袁　红,江素君,尹洪萍. 流式细胞仪在医学实验中的应用. 健康研究.2009,29(4):306-308.